BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun
pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna
asam dan pewarna basa.
Bakteri yang memiliki ciri-ciri berantai karbon (C) yang panjangnya 8– 95
mikrometer dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan
asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel disebut
Basil Aahan Asam (BTA). Bakteri ini ada 41 spesies yang telah diakui oleh ICSB
(International Committe On Systematic Bacteriology) yang sebagian besar sudah
saprofit dan sebagian kecil lainnya patogen untuk manusia
diantaranyaMycobacterium tuberculosa, Mycobacterium leparae dan lain-lainya yang
dapat menyebabkan infeksi kronik. Golongan saprofit dikenal juga dengan nama
atipik.
Mikroorganisme di dunia ini ada yang menguntungkan dan ada juga yang
merugikan. Mikroorganisme yang menguntungkan dapat kita manfaatkan untuk
kepentingan kesejahteraan hidup manusia, akan tetapi, banyak juga mikroorganisme
yang tidak menguntungkan kita yaitu dengan menyebabkan terjadinya penyakit pada
tubuh manusia. Salah satu mikroorganisme yang dapat menyebabkan atau
menginfeksi manusia adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri ini dapat
mengakibatkan penyakit tuberculosis pada manusia. Tuberculosis merupakan salah
satu penyakit yang mematikan dan berbahaya di dunia. Berdasarkan hal inilah yang
menjadi latar belakang dilaksanakannya percobaan ini untuk mengetahui teknik
pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) dan mengamati tingkat infeksi dari sputum
apakah terdapat Mycobacterium atau tidak.

B. Tujuan Praktikum
Untuk mengetahui cara membiakkan bakteri dan jenis bakteri apa yang
terdapat dalam sampel kami.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.

Bakteri yang berbentuk tongkat maupun coccus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil dan tripobasil. Pada
coccus dibagi menjadi Monococcus, Diplococcus dan Staphylococcus. Khusus pada
spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengabsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat
warna mengabsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme
disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan
struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula
fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut
pewarnaan khusus, sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan
mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi
kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah
pewarnaan Ziehl Neelsen yang memilahkan bakteri menjadi kelompok-kelompok
tahan asam dan tidak tahan asam.
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun
1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif, yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya, sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme
yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku .
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel
bakteri, memperluas ukuran jasad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri dan
melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia
jasad dapat diketahui .
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit melengkung,
tidak berspora dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran lebar 0,3 – 0,6 mm dan
panjang 1 – 4 mm. Dinding M. tuberculosis sangat kompleks, terdiri dari lapisan
lemak cukup tinggi (60%). Penyusun utama dinding sel M.tuberculosis ialah asam
mikolat, lilin kompleks (complex-waxes), trehalosa dimikolat yang disebut cord
factor, danmycobacterial sulfolipids yang berperan dalam virulensi. Asam mikolat
merupakan asam lemak berantai panjang (C60 – C90) yang dihubungkan dengan
arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid dan dengan peptidoglikan oleh jembatan
fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri tersebut adalah
polisakarida seperti arabinogalaktan dan arabinomanan. Struktur dinding sel yang
kompleks tersebut menyebabkan bakteri M. tuberculosis bersifat tahan asam, yaitu
apabila sekali diwarnai akan tetap tahan terhadap upaya penghilangan zat warna
tersebut dengan larutan asam – alkohol (Perhimpunan Dokter Paru Indonesia, 2006).
 Komponen antigen ditemukan di dinding sel dan sitoplasma yaitu komponen
lipid, polisakarida dan protein. Karakteristik antigen M. tuberculosis dapat
diidentifikasi dengan menggunakan antibodi monoklonal . Saat ini telah
dikenal purified antigensdengan berat molekul 14 kDa (kiloDalton), 19 kDa, 38 kDa,
65 kDa yang memberikan sensitiviti dan spesifisiti yang bervariasi dalam
mendiagnosis TB. Ada juga yang menggolongkan antigen M. tuberculosis dalam
kelompok antigen yang disekresi dan yang tidak disekresi (somatik). Antigen yang

BAB III
METODE PRAKTIKUM
A. Waktu dan Tempat
Hari/Tanggal :
Jam :
Tempat :

B. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Mikroskop h. Incubator
b. Kaca preparat i. Neraca analitik
c. Ose bulat j. Autoclave
d. Cawan petri k. Erlenmeyer
 e. Ose lurus tabung reaksi l. Hot plate
f. Spoit m. Batang pengaduk
g. Gelas kimia n. Mag Stirer

2. Bahan
a. Donat gula n. KOH 40% 0,2 ml
b. Medium NA o. Naftol 5% 0,6
c. Medium MC p. Aquadest
d. Medium BA q. Darah
e. Medium KIA/TSIA r. Gentian violet
f. Medium MIO s. Lugol
g. Medium MR-VP t. Air fuchsin
h. Medium SCA u. Alkohol 70%
i. Medium LIA v. Kapas
j. Medium UREA w.Bungsen
k. Medium MSA
l. Reagen kovash
m. Reangen MR
C. Prinsip Kerja
Dengan menggunakan sampel minuman dengan menggunakan media
menumpuk, media selektif ,pewarnaan gram, dan uji biokimia agar dapat melihat
bentuk ,jenis bakteri apa yang terdapat pada sampel minuman tersebut.

D. Prosedur Kerja
1. Persiapan awal
Hal yang pertama yang dilakukan adalah membuat media yang akan
digunakan.yaitu : Dibuat media NA sebanyak 240 ml, media MC sebanyak
240 ml, media BA sebanyak 240 ml, maka media KIA sebanyak 70 ml ,media
 MIO sebanyak 60 ml , media VP sebanyak 60 ml , media MR sebanyak 60
ml ,media UREA sebanyak 60 ml ,LIA 60 ml ,SCA 60 ml.

2. Isolasi dan identifikasi bakteri dari dahak

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Dengan menggunaka ose bulat diambil sampel pada bagian yang
purulent atau berwarna kuning kehijauan.
3. Dan diisolasikan pada media BA, AC, dan MC.
4. Media diinkubasi dalam incubator selama 1x24 jam dalam 37oC.
a. Ciri koloni yang tumbuh pada media Mac Conkey Shigella
dan salmonella Tidak berwarna, jernih 2-3 mm, E.coli
Merah, halus 2-3 mm. berwarna Bening (Beta Hemolisis),
warna hijau ke abu-abuan (alpha hemolysis), berwarna
b. Ciri koloni pada media BA yaitu jika merah (gamma
hemolysis)
5. Dilakukan Pewarnaan BTA, pewarnaan Basil Tahan Asam berguna untuk
mengidentifikasi adanya bakteri Mycobacterium Tuberculosisi atau
sejenisnya yang tahan terhadap Asam Alkohol 3%.
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dengan menggunakan ose buat preparat dahak ukuran 2x3
3. Diteteskan larutan carbol fuchsin hingga menutupi ppreparat.
4. Dan di panaskan sediaan dengan sulu api hingga keluar uap kira-kira 5
menit.
5. Dibilas sediaan dengan air dan bilas menggunakan As. Alcohol 3% hingga
sediaan memucat.
6. Dibilas sediaan dengan air mengalir.
7. Ditambahkan methylene blue diatas sediaan biarkan 10-15 detik.
8. Keringkan sediaan dan dibaca pada mikroskop 100x dengan oil emersi.
6. Setelah itu suspense koloni diinokulasikan ke media MC dan MSA kemudian
diinkubasi pada incubator selama 24 jam dengan suhu 37oC. hasil yang tumbu
pada kedua media sebagai berikut.
Ciri koloni yang tumbuh pada media MC adalah E.coli Merah halus, shigella dan
Salmonella yaitu tidak berwarna, jernih.

 Sedangkan pada media MSA yaitu :

Koloni Mikroorganisme
Zone Kuning Staphylococcus yang biasanya bersifat
pathogen, dengan koagulasi positif dan
manitol positif.
Tidak ada perubahan Staphycoccus tidak pathogen dengan
warna. koagulase dan manitol negative

7. Bakteri hasil inokulasi yang telah tumbuh pada media BA, AC dan MC dilakukan
pewarnaan gram untuk mengetahui golongan gram pada bakteri.
a) Dimbil 1-2 koloni letakan pada objek glass difiksasi pada api Bunsen
b) Ditambahkan 1-2 tetes gention violet (diamkan 3 menit) kemudian dicuci
dengan air mengalir
c) Ditammbahkan 1-2 tetes lugol (diamkan 1 menit) kemudiaan dicuci
d) Ditambahkan 1-2 tetes aqudest 96% kemudian dicuci dengan air mengalir
e) Ditambahkan 1-2 tetes air fuksin (diamkan 1 menit) kemudian dicuci dengan
air mengalir
f) Dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop (40X dan 100X)
8. Jika bakteri gram positif coccus maka dilanjutkan dengan uji katalase dan
ditanamkan pada media MSA.
Uji katalase dilakukan dengan cara meneteskan 2-3 tetes larutan H2O2 pada
koloni yang dipisahkan diatas kaca objek, hasil positif bila ada pembentukan
 gelembung udara pada koloni sekitarnya, dimana enzim tersebut mengkatalisis
H2O2 dengan enzi katalase.
9. Dan inokulasikan pada media TSIA untuk uji Hidrogen Sulfida H2S. inkubasikan
media pada incubator semalam atau 24 jam suhu 370C. dan amati setiap
perubahan yang terbentuk pada uji.
Hasil reaksi pada media uji TSIA.
Butt bersifat Asam (Kuning) Glukosa difermentasikan
Slant bersifat Basah (Merah)
Pada seluruh media terlihat Laktosa atau sukrosa atau
pembentukan asam. Seluruh media keduanya difermentasikan.
berwarna kuning.
Pembentukan gas di bagian butt Pembentukan gas misalnya H2 dan
media kadangkala terpecah. CO2
Endapan hitam di bagian butt Pembentukan H2S
Seluruh media berwarna merah, Ketiga macam gula tidak
bagian butt dan slant berarna difermentasikan.
merah (basah).

10. Setalah dilakukan uji pada media TSIA maka koloni diinokulasikan ke media uji
IMVIC (Indol-methyl Red-Voges Proskauer-Citrate) yaitu uji Biokimia media
MIO, MR, VP, SCA LIA, UREA diinkubasi pada inkubator.
 MIO pada media MIO ditambahkan reagen kovacs 10-12 tetes dan diamati
perubahan yang terjadi.
 Uji MR pada uji ini setelah media diinkubasi, maka ditambahkan 5 tetes
larutan Methyl Red positif jika larutan kaldu berwarna merah dan negative
berwarna kuning.
 Uji VP pada uji Voges-Proskauer kaldu ditambahkan 10 tetes larutan 40 %
KOH dan 15 tetes larutan alpha-naphtol pada kaldu MR-VP hasil akan terjadi
 < 30 menit. Positif jika kaldu berwarna merah dan negative jika tidak ada
perubahan warna.
 Media SCA (Simon Citrate Agar) yaitu uji penggunaan citrate sebagai
sumber karbon. Hasil positif jika media berubah warna menjadi biru dari
warna hijau.
 Media UREA adalah untuk uji bakteri yang menhasilkan enzim urease yang
mengurai urea menjadi ammonia dan CO2. Hasil positif jika media berubah
dari warna merah jingga menjadi merah ungu.
11. Diamati hasil pada uji Indol- Methyl-Red-Vorges proskauer-dan Citrate dan
media-media lainya dan dicatat, dan lihat hasil jenis bakteri sesuai table.
 BAB IV
HASIL PENGAMATAN
A. Hasil Praktikum
1. Table
CIRI-CIRI PERTUMBUHAN PADA KIA

NO SAMPEL SLANK BUTT GAS H2S KETER

ANGA
N

1 BA A A + - Gram (-
) basil

2 AC ALK A + - Gram
(+)
coccus

CIRI-CIRI MEDIA
NO SAMPEL MIO KETER
M I O MR VP SCA UREA LIA ANGA
N

1. AC + - + + + + - + Staphyl
ococcus
aureus

2. BA + - + + - + - + Pseudo
monas
pseudo
malei
2. Gambar

3. Pembahasan
Pada praktikum ini, kami melakukan pengamatan bakteri pada sampel
sputum. Hal pertama yang dilakukan itu adlaah membuat media sebagai
wadah untuk diisolasi sampel sehingga menghasilkan biakan. Setelah itu, kita
,ealukan pewarnaan zeel neelshen untuk mengetahui pisiti atau negative samel
tersebut memiliki pentakit TB. Jika hasil pewarnaan tersebut negative maka
kita lanjytkan dengan sampel tersebut diinkubasi 1×24 jam dalam suhu 37oC
maka sampel ini diinokulasi dari media MC, AC dan BA. Setelah itu,
dilakukan pewarnaan gram dan pada hasil untuk media MC didapatkan hasil
gram (-) basil, media BA didapatan gram (-) basil, dan pada media AC
didapatkan gram (+) coccus. sehingga kami mengambil biakan sampel pada
media AC tersebut untuk dilakukan uji katalase. Katalase yaitu enzim yang
mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) meenjadi air dan
O2. Hydrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini
mengaktifkan enzim dalam sel.
Dilakukan inokulasi dari media BA menggunakan ose yang telah
pijarkan di api Bunsen, stelah itu dilakukan 2 teknik yaitu teknik tusuk dan
gores pada media KIA/TSIA pada media BA didapatkan hasil dari koloninya
berwarna putih kehitaman yang munkin disebabkan adanya kontaminasi dari
luar dan bergerombol. Sedangkan pada media AC ke media KIA/TSIA,
dimana pada prosedur ini menggunkan 2 teknik yaitu teknik gores dan tusuk
namun pada saat melakukan penusukan tidak boleh sampai dasar. Setelah
diinubasi selama 1×24 jam dalam suhu 37oC maka dilakukan pengamatan
pada media KIA/TSIA tersebut . dipatkan hasil berwarna putih putih
bergerombol.
Pada saat mengamati dimedia KIA/TSIA dari BA didapatkan hasil
pada slank tabung didapatkan berwarna merah maka sifatnya alkali, karena
tidak bisa memfermentasikan gula dan pada butt nya berwarna kuning maka
sifatnya acid, yang berarti daapat memfermentasikan gula Jika pada bekas
tusukannya berwarna hitam maka itu menunjukkan mengandung belerang
(H2S), sedangkan jika berbentuk gelembung, pecah-pecah pada tususkannya
maka menunjukkan kalau itu mengandung gas. Hal ini dapat terjadi karena
sewaktu diinokulasi tabung yang berisi kaldu dikocok terlalu keras atau bila
digunakan kaldu yang disimpan dalam lemari es. Daya larut oksigen
berkurang dalam kaldu yang dingin, namun sewaktu diinkubasika pada suhu
37oC oksigen dapat terperangkap dalam tabung durham.
 kami melakukan inokulasi ke media MIO, VP, MR, SCA, LIA,
UREA. Setelah diinkubasi selama 1×24 jam dalam suhu 37oC, dilakukan uji
biokimia. yaitu pada media MIO ditambahkan reagen kovash. Pada praktikum
ini kami mendapatkan hasil pada media AC dan BA untuk M yaitu positif
karena berwarna keruh pada tusukan yang dimana kekeruhan tersebut
disebabkan oleh sampel yang ditanam dapat bergerak sehingga dapat merubah
warnah pada bekas tusukan. Pada indol kami mendapatkan hasil negative
karena tdak terdapat cincin merah pada permukaan yang dimana hal itu dapat
disebabkan oleh triptopan yang akan diubah menjadi indol yang ditambahkan
kovash sehingga terjadi pembentukan warna pada permukaan berups cincin
merah akibat pengumpulan indol. Dan pada orniti, kami mendapatkan hasil
positif juga karena tidak berubahnya warna menjadi kuning setelah
ditambahkan reagen. Dimana perubahan warna kuning tersebut terjadi Karena
di dalam MIO terdapat nutrisi yang dibutuhkan oleh bakteri jika di tambah
kovash akan menggunakan orniti pada media sehingga membentuk warna
kuning.
Pada media VP ditambahkan 40% KOH dan 5% alphanaphtol
didapatkan hasil negative padamedia BA karena tidak berubah menjadi
merah, sedangkan apada medi AC didapatkan hasil positif karena adanya
perubahan warnah menjadi merah. Dimana warnah merah tersebut disebabkan
oleh pengocokan yang baik sehingga meningkatkan acrasi yang
menyebabkan peningkatan oksidasi 2,3 butanadiol menjadi asetoin dan
memeperjelas hasil reaksi uji ini. Pada media MR ditambahakn reagen methyl
red dan hasil yg didapatkan itu positif karena berubah menjadi warnah merah
setelah ditabahkan reagen tersebut. Perubahan warna itu disebabkan oleh
terjadinya afermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarnah
merah. Sealin itu, penambahan methyl red ini dapat menunjukkan adanya
perunahan pH menjadi asam . methyl red ini berwarnah merah pada
lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kunng dalam lingkungan pH 6,2.
 Pada media yang bisa langsung didentifikasi tanpa penambahan
reagen yaitu SCA yang dimana pada praktikum ini kami mendapatkan hasil
positif karena ada perubahan warna dari hijau ke biru. Pada UREA juga kami
mendapatkan hasil negative karena tidak adanya perubahan warna menjadi
ungu. Kenapa dapat berubah menjaddi warna karena terjadi hidrolisi pada
urea. Pada LIA di dapatkan hasil positif karna adanya perubahan warnah
menjadi ungu yang disebabakn oleh perubahan pH asam ke ph basa.
Jika ditinjau dari hasil praktikum tersebut maka kami menfdapatkan
sampel staphylococcus safrotikus karena pada pewarnaan gra media kami
berwarna bening yakni beta hemolysis.
Staphylococcus aureus merupakan mikro flora normal manusia.
Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernapasan atas dan kulit.
Keberadaan stapylococcus aureus ini pada saluran pernapasan atas dan kulit
pada individu jarang menyebabkan penyakit, individu sehat hanya berperan
sebagai carrier. Infeksi serius akan terjadi ketika resistensi inang melemah
karena adanya perubahan hormone adanya penyakit, luka.
Pseudomona pseudomallei merupakan bakteri yang merupakan
penyakt menular yang di sabut melioi dosis atau penyakit whitmore yang
paling sering terjadi di asia tenggara dan Australia tenggar. Bagi manusia
mandapatkan penyakit ini dengan cara menghirup debu yang terkontaminasia
atau bila tanah yang terkontaminasi oleh bakteri bersentuhan dengan kulit
yang terkikis atau tergores, gejala umum mediodosis ini tidak spesifik tapi
sering timbulkan penyakit seperti sakit kepala, demam, menggigil, batuk,
nyeri dada dan kehilangan nafsu makan.
 BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Pada praktikum ini dapat disimpulkan bahwa has
yang didapat pada isolasi dan identifikasi pada air bassang yaitu didpatkan
jenis bakteri staphylococcus aureus. Yang diambil dari biakan AC yang gram (+)
berbentuk coccus. Yang didapat dari uji katalase yakni pada katalase positif
terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni. Dan didapatkan jenis
bakteri pneudomonas pseudomalei pada biakan BA.

B. Saran
Pada praktikum ini, memerlukan ketelitian dan kesabran yang tinggi pada
pengerjaan isolasi dan inokulasi supaya hasil yang didapatkan akurat dan sesuai
dengan yang diinginkan.
 DAFTAR PUSTAKA
Joel Karundeng R dkk,2016. Identifikasi dan Uji Sensifitas Bakteri yang
diisolasi dari Sputum Penderita Pneuminia Di RSUP Prof. DR. R.
D. Kandou Manado Terhadap Antibotik Eritromisin Seftriakson
dan Sefadroksil. Manado: PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi –
UNSRAT Vol. 5 No. 4 NOVEMBER 2016 ISSN 2302 – 2493.

Mercy,2015.http://laporanbakteriologi.blogspot.co.id/2016/05/laporan-
lengkapidentifikasi-bakteri.html