Laporan Praktikum

Mikrobiologi

Disusun Oleh:
Annisa Mayasni (1911201006)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN & ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ABDURRAB
2021
 IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MIKROSKOPIS (PEWARNAAN GRAM
DAN PEWARNAAN TAHAN ASAM METODE ZIEHL – NEELSEN)

A. Tujuan Praktikum :
 Memperkenalkan prosedur identifikasi bakteri secara mikroskopis dengan
metode pewarnaan Gram dan membedakan bakteri berdasarkan sifat pewarnaan
Gram
 Memperkenalkan prosedur identifikasi bakteri secara mikroskopis dengan
metode Ziehl-Neelsen dan mampu mengidentifikasi sifat tahan asam dari
Bakteri Tahan Asam (BTA)

B. Teori Praktikum :
1. Pewarnaan Gram Positif dan Negatif
Salah satu ciri taksonomi pada bakteri adalah respon mereka terhadap
pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram merupakan suatu metode yang mendasar untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok berdasarkan sifat kimia dan
fisik dari dinding selnya, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853–1938).
Dinding sel merupakan lapisan selubung sel yang terletak diantara membran
sitoplasma dan kapsul. Dinding sel bakteri bersifat kaku dapat berperan dalam
mempertahankan bentuk dan melindungi sel dari perubahan tekanan osmotik antara
sel dengan lingkungannya. Dinding sel bakteri Gram positif tersusun atas
peptidoglikan yang tebal (90%) dan membran sitoplasma, sedangkan dinding sel
bakteri Gram negatif tersusun atas tiga lapisan yaitu membran luar, peptidoglikan
yang tipis (5-20%), dan membran sitoplasma (Gambar 1). Pada bakteri Gram
negatif bagian luar sel terdapat komponen berupa lipopolisakarida (LPS), tetapi
tidak semua bakteri Gram negatif memiliki LPS. LPS merupakan substansi
berbahaya yang berperan sebagai endotoksin.
 Gambar 1. Perbedaan dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif

Berikut beberapa kelompok bakteri yang diklasifikasikan berdasarkan morfologi

selnya (pewarnaan Gram), yaitu:
1. Coccus Gram (+)
• Staphylococcus spesies patogen paling utama: S. aureus, penyebab
pneumonia, meningitis, empiema, endokarditis, atau sepsis dengan supurasi di
berbagai organ.
• Streptococcus spesies patogen paling utama: S. pyogenes, penyebab faringitis,
impetigo, atau demam reumatik, S. agalactiae, penyebab sepsis dan meningitis
pada neonatus, dan S. pneumoniae, penyebab pneumonia, sinusitis, otitis,
bronkitis, bakteremia, meningitis dan infeksi lainnya.

2. Bacil Gram (-)

Meliputi famili bakteri fakultatif Enterobacteriaceae, yang merupakan flora normal
pada manusia dan hewan serta dapat ditemukan di lingkungan.
Berikut beberapa genus bakteri yang patogen: Salmonella (S. typhi, dsbnya),
Shigella (S. dysenteriae, dsbnya), Escherichia (E. coli), Proteus, dan Yersinia, serta
genus Proteus yang merupakan patogen penting di rumah sakit (infeksi
nosokomial).
 Gambar 2. Bentuk-bentuk sel bakteri

2. Pewarnaan Tahan Asam Metode Ziehl-Neelsen

Beberapa bakteri tertentu tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana
ataupun Gram, misalnya genus Mycobacterium, Retinomycites, dll. Hal ini
disebabkan sel-sel bakteri diselubungi oleh semacam komponen lilin (lipid) dan
asam mycolat, sehingga selnya sukar ditembus oleh zat-zat warna. Tetapi bakteri
tersebut dapat diwarnai dengan larutan carbol fuchsin (sambil dipanaskan), dimana
zat warna ini dapat meresap dan diikat oleh sel bakteri. Keistimewaan dari bakteri
tersebut yaitu zat warna yang telah diikat sukar dilepaskan walaupun dilakukan
dengan pencucian dengan alkohol-asam, misalnya asam sulfat atau asam klorida.
Oleh karena bakteri-bakteri seperti ini tahan terhadap pencucian asam-asam
mineral, maka bakteri ini disebut dengan Bakteri Tahan Asam (BTA).
Pewarnaan tahan asam ini digunakan untuk mendeteksi adanya bakteri tahan
asam (BTA), seperti genus Mycobacterium. Terdapat lebih dari 50 spesies
Mycobacterium, sebagian besar merupakan organisme lingkungan yang jarang
menyebabkan infeksi pada manusia. Spesies patogen bakteri tahan asam yang
umumnya menginfeksi manusia adalah Mycobacterium tuberculosis, penyebab
penyakit tuberkulosis (TBC/TB) dan Mycobacterium leprae, penyebab penyakit
lepra atau kusta.
 Hasil pemeriksaan BTA dilaporkan berdasarkan IUATLD (International Unit
Associated Treatment Lung Disease). Kriterianya antara lain sebagai berikut:

tidak ada BTA / 100 LP tidak ada BTA

1 - 9 BTA / 100 LP hasil dilaporkan

10 - 99 BTA / 100 LP BTA + (positif satu)

1 - 10 BTA / LP BTA ++ (positif dua)

10 BTA / LP BTA +++ (positif tiga)

C. Alat dan Bahan

Pewarnaan Gram Positif dan Negatif
Alat yang digunakan meliputi: bunsen, korek api, jarum ose, pipet tetes, kaca
objek (glass object), kaca tutup, baskom pewarnaan, wadah, rak tabung, mikroskop.
Bahan yang digunakan meliputi: beberapa stok kultur bakteri dari
Laboratorium Mikrobiologi Universitas Abdurrab, larutan kristal violet, larutan
lugol’s iodin (mordant), alkohol 96% (decolorator), alkohol 70%, larutan safranin
(counter stain), aquadest steril, immersion oil, marker atau label, spiritus.
Pewarnaan Tahan Asam Metode Ziehl-Neelsen
Alat yang digunakan meliputi: bunsen, korek api, jarum ose, pipet tetes, kaca
objek (glass object), kaca tutup, baskom pewarnaan, wadah, rak tabung, skapel,
plester, mikroskop.
Bahan yang digunakan meliputi: sputum segar (sputum pagi) atau sampel
cuping telinga, larutan carbol fuchsin, larutan H2SO4 3% dalam alkohol absolut
(asam alkohol), larutan methylen blue atau malachite green, aquadest steril,
immersion oil, alkohol 70%, spiritus.

D. Cara Kerja :
Pewarnaan Gram Positif dan Negatif
1. Letakkan 1 tetes aquadest steril pada kaca objek (object glass), kemudian
ambil 1 ose bakteri dan diratakan menggunakan ose. Selanjutnya difiksasi
dengan tujuan agar sel bakteri tertempel pada permukaan kaca objek dan tidak
lepas saat dilakukannya proses pewarnaan Gram.
2. Teteskan sebanyak 2-3 tetes preparat dengan larutan kristal violet selama 1
menit.
3. Buang sisa cat dan bilas dengan aquadest steril.
4. Teteskan sebanyak 2-3 tetes preparat dengan larutan lugol’s iodin selama 2
menit.
5. Buang sisa cata dan bilas dengan aquadest steril.
6. Beri larutan pemucat (decolorizing) dengan alkohol 96% selama 15-30 detik.
Catatan: hati-hati dalam pelunturan, lakukan dengan menuangkan tetes demi
tetes alkohol sampai warna kristal violet kepucatan.
Pelunturan jangan terlalu lama.
7. Buang sisa larutan dan bilas dengan aquadest steril.
8. Teteskan sebanyak 2-3 tetes preparat dengan larutan safranin selama 30 detik.
9. Buang sisa cat dan bilas dengan aquadest steril.
10. Keringkan preparat dengan menggunakan kertas serap (blotting) secara hati-
hati, jangan digeserkan yang akan berakibat lepasnya preparat.
11. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
12. Gambarkan hasil pengamatan beserta interpretasinya.

Gambar 3. Prosedur pewarnaan Gram

Pewarnaan Tahan Asam Metode Ziehl-Neelsen
1. Teteskan sebanyak 1 tetes aquadest steril pada kaca objek menggunakan pipet
tetes, kemudian diambil sebanyak 1 ose sputum secara aseptik, lalu dioleskan
rata di atas kaca objek.
2. Fiksasi preparat di atas api bunsen hingga kering/nempel di atas kaca objek.
3. Teteskan preparat dengan larutan carbol fuchsin sebanyak 2-3 tetes selama
5 menit (sambil dipanaskan di atas bunsen sampai terjadi penguapan.
Catatan: jangan sampai mendidih atau hangus).
4. Buang sisa cat dan bilas dengan aquadest.
5. Teteskan preparat dengan larutan H2SO4 3% sampai cat tampak larut semua.
6. Buang sisa cat dan bilas dengan aquadest.
7. Teteskan preparat dengan larutan methylen blue atau malachite green selama
1-2 menit.
8. Buang sisa cat dan bilas dengan aquadest.
9. Keringkan preparat dengan menggunakan kertas serap (blotting) secara hati-
hati, jangan digeserkan yang akan berakibat lepasnya preparat.
10. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
11. Gambarkan hasil serta interpretasinya.

E. Pembacaan dan Interpretasi

Pewarnaan Gram Positif dan Negatif
Bakteri Gram positif : sel bakteri berwarna ungu
Bakteri Gram negatif : sel bakteri berwarna merah muda
 Gambar 3. Hasil pewarnaan Gram positif dan Gram negatif

Pewarnaan Tahan Asam Metode Ziehl-Neelsen

• Bakteri tahan asam : sel berwarna merah, bentuk batang halus disertai non BTA
• Bakteri tidak tahan asam : berwarna biru

Gambar 1. Hasil Pewarnaan Tahan Asam

F. Hasil dan Pembahasan

1. Pewarnaan Gram Positif dan Negatif
 Gambar 1. Bakteri Staphylococcus Aureus

Dari hasil gambar 1 yang diperoleh tampak jelas bakteri berwarna ungu, hal ini
menunjukkan bahwa bakteri tersebut tergolong kedalam bakteri Gram positif
karena bakteri Gram positif dapat menyerap zat warna kristal violet yang berwarna
ungu. Bentuk bakteri secara mikroskopis merupakan cara untuk melihat
karakteristik dari suatu bakteri yaitu berbentuk bulat, batang dan koma.
Pada penelitian ini ditemukan bakteri berbentuk bulat yang berarti termasuk ke
dalam bakteri golongan kokus (Safrida dkk., 2012). Bakteri Gram positif berbentuk
kokus dimungkinkan bakteri golongan Staphylococcus atau Streptococcus (Brook
dkk., 2005).
 Gambar 2. Bakteri E. Colli

Pada uji biokimia menunjukkan bahwa Escherichia coli termasuk bakteri Gram
negatif. Hal ini ditandai dengan warna merah dari safranin pada pengamatan
mikroskopis. Gram negatif memiliki ciri yakni lapisan peptidoglikan yang tipis
dibandingkan bakteri Gram positif. Dinding sel pada Enterobacteriaceae termasuk
Escherichia coli terdiri dari membran dalam sitoplasmik dan membran luar yang
mengandung lipopolisakarida (LPS) & lipoprotein. LPS terdiri dari lipid A, polisakarida
dan antigen O. Periplasmik merupakan celah antara membran sitoplasmik dalam dan
membran luar lipid. Celah ini mengandung rantai peptidoglikan yang ditemukan pada
bakteri Gram positif, sedangkan pada Gram negatif lebih sedikit mengandung
peptidoglikan (Lovering et al., 2005).
Peptidoglikan merupakan komponen essensial untuk dinding sel bakteri.
Komponen ini memproteksi organisme dari tekanan osmotik, menentukan bentuk sel
dan berintegrasi dengan pertumbuhan sel. Peptidoglikan (disebut juga murein)
merupakan polimer (molekul besar) yang terdiri atas perulangan disakarida yang
tersusun atas monosakarida N-acetylglucosamine (NAG) dan Nacetylmuramic acid
(NAM). NAG dan NAM melekat pada suatu peptida yang terdiri dari 4 atau 5 asam
amino yaitu L-alanin, D-alanin, asam D-glutamat, L-lisin atau asam diaminopimelat,
dan membentuk selubung mengelilingi sel. Pada struktur dinding sel bakteri ini
ditemukan konfigurasi D-asam amino yang berbeda dengan konfigurasi asam amino di
alam yang umumnya dalam bentuk L. NAM dan NAG saling berikatan dalam ikatan β-
1-4-glukosida, dan membentuk rantai yang disebut tetrapeptida (Pratiwi, 2008).
Bakteri ini dapat diwarnai dengan krital violet dan lugol tetapi dengan alkohol
96% pewarna akan luntur karena lapisan dinding sel yang bermuatan positif mengikat
pewarna yang bermuatan negatif tidak terlalu kuat karena lapisan peptidoglikan yang
tipis. Sehingga bila diberikan warna sekunder yakni safranin akan terwarnai pada
pengamatan mikroskopis. Hasil dari percobaan yang dilakukan yakni terbukti bahwa
bakteri e.colli merupakan bakteri gram negatif.

Gambar 3. Bakteri M.Tuberculosis

Hasil yang didapatkan pada saat praktikum,tampak pada gambar 3. Bahwa pada
sputum pasien TB yang digunakan terdapat bakteri M.Tuberculosis. Mycobacterium
tuberculosis mempunyai sifat khusus yaitu tahan terhadap asam pada pewarnaan Zielh-
Nelssen, oleh karena itu disebut pula Bakteri Tahan Asam (BTA). Bakteri ini cepat mati
dengan sinar matahari langsung, tetapi dapat hidup beberapa jam ditempat yang gelap
dan lembab. Dalam jaringan tubuh bakteri ini dapat bertahan lama selama beberapa
tahun (Ichwan, 2009). Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri aerob obligat dan
parasit intraseluler fakultatif dan memiliki waktu generasi yang lambat antara 15-20
jam.
Mycobacterium tuberculosis tidak bisa diklasifikasikan sebagai bakteri gram
positif atau gram negatif karena tidak memiliki karakteristik kimia yang baik, meskipun
bakteri ini mengandung peptidoglikan dalam dinding sel mereka. Jika pewarnaan gram
dilakukan pada Mycobacterium tuberculosis maka akan terlihat warna yang sangat
lemah pada gram positif atau tidak terlihat sama sekali (Todar, 2012). Sebagian besar
Mycobacterium tuberculosis menyerang paru tetapi dapat juga menyerang organ tubuh
yang lain. Sumber penularan dari bakteri ini adalah melalui inhalasi dari manusia ke
manusia secara kontak langsung lewat udara melalui percikan sputum yang
mengandung partikel Mycobacterium tuberculosis (Widyaningsih, 2008). udara melalui
percikan sputum yang mengandung partikel Mycobacterium tuberculosis
(Widyaningsih, 2008).

G. Daftar Pustaka
1. http://jim.unsyiah.ac.id/FKH/article/view/8197/3532
2. http://repository.uma.ac.id/bitstream/123456789/126/5/128700015_file5.pdf
3. http://journal.unnes.ac.id/sju/index.php/LifeSci