MIKROBIOLOGI

Ada beberapa teknik dasar di dalam analisa mikrobiologi yang harus diketahui,
meliputi

1. Teknik
2. Agar
3. Turbiditas

transfer
Slants
media

4. Teknik
5. Teknik
6. Teknik

aseptis
(Agar

broth

(kekeruhan

Dilusi
Pour-Plate
Spread

miring)
kaldu)
(pengenceran)

(lempeng
Plate

(lempeng

tuang)
sebar)

7. Teknik Streak Plate (lempeng gores)

1)- TEKNIK TRANSFER ASEPTIS
Teknik transfer aseptis adalah suatu metode atau teknik di dalam memindahkan
atau mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis
agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik transfer
aseptis ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus
diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi.
Ada beberapa aturan yang harus diketahui dan dipenuhi di dalam teknik transfer
aseptis ini, sebagaimana terangkum dalam tabel di bawah :
Aturan Teknik Transfer Aseptis
Sebelum Pelaksanaan :
- Singkirkan semua barang yang tidak diperlukan dari meja dan ruang
kerja
- Kenakan pakaian atau jas laboratorium yang bersih dan higinis sebelum
masuk ke dalam laboratorium
- Dianjurkan untuk mengenakan masker yang bersih dan higinis
- Kenakan penutup rambut yang bersih dan higinis
- Jangan sekali-kali meletakkan tabung dan peralatan laboratorium
lainnya di luar laboratorium
Sebelum dan Setelah Pelaksanaan :
- Cuci tangan anda dengan bersih dan gunakan antiseptis
- Sanitasi dan desinfeksi ruang kerja (laboratorium dan sekitarnya)
dengan desinfektan yang memadai, termasuk Laminar Air Flow dan
Inkubator

- Sterilisasi semua alat dan bahan sebelum digunakan

Ketika Pelaksanaan Kultur :
- Jangan berbicara
- Bekerjalah di dekat api (pembakar bunsen) dan di dalamLaminar Air
Flow
- Bukalah tabung atau cawan di atas api dan jauhkan dari
hidung dan mulut anda
- Usahakan jangan meletakkan tutup (kapas penutup) tabung
reaksi di atas lantai/alas meja atau laminar
- Miringkan tutup cawan petri yang akan dibuka sebagai
penghalang antara kultur dengan mulut dan hidung anda
- Jangan buka tutup cawan petri terlalu lebar dan terlalu lama
- Bekerjalah dengan cepat

Setelah Pelaksanaan :
- Segera tutup semua tabung atau cawan yang masih terbuka
- Singkirkan segera semua peralatan atau bahan sisa yang sudah
tidak digunakan lagi
- Bersihkan dan keringkan segera tumpahan-tumpahan media
yang ada
- Sanitasi dan desinfeksi ulang ruang kerja (laboratorium anda)
- Lepas pakaian kerja dan jas laboratorium anda sebelum
meninggalkan ruang kerja anda

Di dalam teknik transfer aseptis ada beberapa teknik yang perlu difahami,
yaitu
1) Inoculating (inokulasi) dengan
2) Pipetting (mentransfer

:
jarum
dengan

ose
pipet)

3) Alcohol Flamming (mentransfer dengan forsep yang dibakar dengan alkohol)

a) Inoculating dengan jarum ose
a) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian
lup (ujung) sampai berpijar merah.
b) Biarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang, kemudian
segera ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya

dengan ketiga jari tengah, manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk
dan ibu jari memegang jarum ose.
c) Bakar bibir tabung reaksi dengan cara memutar tabung sehingga
semua bagian bibir tabung terkena api.
d) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu segera
keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose jangan sampai
menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen.
e) Bakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup. Ingat, jarum ose
jangan dibakar kembali karena akan membunuh bakteri yang akan
diinokulasikan.
f) Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya
dengan cara yang sama dengan cara (b) dan bakar bibirnya dengan cara
yang sama dengan cara
g) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung tadi sebagaimana cara
(d).
h) Bakar bibir tabung reaksi dan tutup sebagaimana cara.
i) Bakar kembali jarum ose sebagaimana cara (a).
j) Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan dilusi atau
pengenceran.
b) Pipetting
a) Ambil pipet yang telah steril, buka pembungkusnya dan pasang katup
karetnya.
b) Bakar ujungnya dibakar atas bunsen selama beberapa detik. Jangan
terlalu lama karena dapat merusak ujung pipet.
c) Ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya
dengan kedua jari manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk, jari
tengah dan ibu jari memegang pipet.
e) Segera masukkan pipet ke dalam tabung reaksi, tekan katup karet
penghisap tombol [S] (lihat gambar di bawah) lalu segera keluarkan.
Usahakan ketika memasukkan pipe t jangan sampai menyentuh dinding
tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen.
f) Bakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup.
g) Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya

dengan cara yang sama dengan cara (b) dan bakar bibirnya dengan cara
yang sama dengan cara.
h) Segera masukkan pipet ke dalam tabung tadi, kemudian keluarkan
cairan yang telah diinokulasi dari pipet dengan menekan tombol [E].
i) Bakar bibir tabung reaksi dan tutup sebagaimana cara.
j) Pindahkan pipet dan ganti dengan pipet baru apabila akan
melakukan pipettingkembali.
k) Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan dilusi atau
pengenceran.
c) Alcohol

Flamming

Biasanya digunakan untuk meletakkan kertas cakram atau instrumen

lain ke dalam cawan petri yang berisi media.
a) Ambil forsep, celupkan ujungnya ke dalam alkohol, lalu segera bakar
ujungnya di atas bunsen selama beberapa detik secara mendatar. Ingat,
jangan miring sebagaimana gambar di bawah.
b) Ambil kertas cakram steril atau instrumen lainnya dengan forsep tadi.
c) Ambil tabung reaksi yang berisi zat antimikrobial, celupkan kertas
cakram tadi ke dalam cairan di dalam tabung reaksi.
d) Ambil cawan petri yang telah berisi biakan bakteri di dalam agar, buka
penutupnya dengan cara memiringkan beberapa derajat hingga hanya
pada satu sisi bagian saja yang terbuka. Ingat jangan terlalu lebar
membukanya atau me mbuka seluruh tutupnya dari cawan.
f) Segera masukkan kertas cakram steril atau instrumen lainnya dengan
forsep secara hati-hati agar tidak merusak permukaan agar. Lakukan di
dekat pembakar bunsen.
g) Segera tutup dan bakar kembali bibir cawan.
h) Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan.
2)- TEKNIK

AGAR

SLANTS

Agar slants adalah kultivasi biakan mikroba ke dalam agar miring di dalam
tabung reaksi untuk melihat karakteristik koloni bakteri yang tumbuh. Tiap
bakteri memiliki karakteristik koloni yang berbeda. Karakteristik yang diamati
pada koloni bakteri yang tumbuh adalah :

Tabel 5 : Karakteristik Pertumbuhan Koloni Bakteri

1. Ukuran : Diameter koloni yang diukur di dalam mm atau cm2. Bentuk
Keseluruhan Koloni : Sirkular, irregular, punctiform, rhizoid
3. Tepi / Margin : Entire, lobate, erose, undulate
4. Elevasi : Datar (flat), raised, convex (cembung), pulvinate, umbonate,
crateriform
5. Permukaan : Wrinkled, rough (kasar), concentric rings, dull, glistening,
waxy
6. Pigmentasi :
1. Warna : merah, kuning, krim, putih, tidak berwarna
2. Kelarutan dalam air : larut dalam air, tidak larut dalam air
1. Opasitas : Transparan, translucent, opaque
2. Bau : manis, putrefactive, fruity
Cara Kerja :
a) Tuang media Agar ke dalam tabung reaksi secara aseptis
b) Dinginkan dalam keadaan miring (+ 20-30 )
0

c) Streak agar miring dengan biakan mikroba dengan jarum ose secara
aseptis.
d) Inkubasi ke dalam inkubator dan amati bentuk koloni yang tumbuh
3)- TURBIDITAS MEDIA KALDU
Serupa dengan teknik agar slants, namun teknik turbiditas menggunakan
media broth(kaldu) dan yang diamati adalah karakteristik kekeruhannya. Tiap
mikroorganisme memiliki karakteristik turbiditas (kekeruhan) yang berbedabeda. Ada diantara mikroorganisme yang membentuk partikel melayang
(flocculent) di dalam media broth. Ada yang tersedimentasi, melayang di
permukaan saja (pellicle) dan ada pula yang melayang di permukaan berbentuk
seperti cincing (ring). Sebagaimana gambar di bawah.
Cara Kerja :
a) Tuang media broth ke dalam tabung reaksi secara aseptis
b) Ambil dengan cara menstreak biakan mikroba dari kultur.
c) Transfer dengan cara menstreak ke dalam tabung reaksi yang berisi
broth tadi
d) Inkubasi ke dalam inkubator dan amati bentuk koloni yang tumbuh

4)- TEKNIK

DILUSI (PENGENCERAN)

Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua
metode perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti TPC
(Total Plate Count).
Cara

Kerja

- Dari larutan kultur kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades
atau

larutan

buffer

pepton

untuk

memperoleh

dilusi

1/10

bagian.

- Dari larutan dilusi 1/10 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml
aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian.
- Dari larutan dilusi 1/100 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml
aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1000 bagian.
- Dari larutan dilusi 1/1000 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml
aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian.
- Dst
Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 dst adalah suatu rasio dilusi yang
apabila pada tiap dilusi ditumbuhkan ke dalam suatu media dan koloninya yang
tumbuh dapat dihitung, maka jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan cara :
1
Jumlah koloni x

Pengenceran

Misal

Apabila pada dilusi 1/100 tumbuh sebanyak 20 koloni, maka dapat diketahui
jumlah sel adalah :
1
20 koloni x

1/100

= 2000 sel

Apabila pada dilusi 1/1000 tumbuh sebanyak 3 koloni, maka dapat diketahui
jumlah sel adalah :
1
2 koloni x

1/1000

= 3000 sel

Oleh karena itu, dengan metode dilusi kita dapat memperkirakan jumlah sel
mikroba pada suatu benda atau produk.
TEKNIK POUR

PLATE

Teknik pour plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar
yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji
TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang
tumbuh dapat tersebar merata pada media agar.
Cara Kerja :
Teknik pour plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar
yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji
TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang
tumbuh dapat tersebar merata pada media agar.Cara Kerja :
a) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml
aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.
b) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan
telapak tangan selama beberapa kali.
c) Pipet larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri.
d) Tuang media agar yang masih cair (suhu + 50 C) ke dalam cawan petri
tadi.
o

e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk

mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba.
f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.
5)- TEKNIK SPREAD
Teknik

spread

plate

PLATE
(lempeng

sebar)

adalah

suatu

teknik

di

dalam

menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan

stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah
memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri
dilakukan

setelah

media

agar

memadat

sedangkan

pour

plate

kultur

dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini

adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian

permukaan media agar.
Cara Kerja 1 : (dengan pipetting)
a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga
mengeras.
b) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml
aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.
c) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan
telapak tangan selama beberapa kali.
d) Pipet larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri.
e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja untuk meratakan
larutan dilusi tadi di atas permukaan media agar.
f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.
Cara Kerja 2 : (dengan swab/apus)
a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga
mengeras.
b) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml
aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.
c) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan
telapak tangan selama beberapa kali.
d) Masukkan swab stick (tangkai apus) steril ke dalam tabung reaksi
hingga bagian kapasnya tenggelam di dalam larutan dilusi. Usahkan
memasukkan tangkai apus jangan sampai menyentuh dinding tabung
reaksi.
e) Apus ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan secara merata.
Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores.
f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.

6)- TEKNIK STREAK PLATE

Teknik streak plate (lempeng gores) adalah suatu teknik di dalam

menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara
menstreak (menggores) permukaan agar dengan jarum ose yang telah
diinokulasikan

dengan

kultur

bakteri.

Dengan

teknik

ini

mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan

inokulum bekas dari streak jarum ose.
Cara Kerja :
a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga
mengeras.
b) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup
(ujung) sampai berpijar merah.
c) Bakar bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri dengan cara
memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api.
d) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu segera
keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose jangan sampai
menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen.
e) Bagi tiga bidang permukaan atas cawan petri yang akan distreak
dengan spidol atau lainnya.
f) Streak ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan. Ingat, usahakan
jangan sampai agar hancur atau tergores.
g) Arah streak pada permukaan agar menurut pembagian bidang tadi.
Kemudian inkubasi dan amati koloninya.