NAMA NIM

: CARINA AGOESTIN INTAN WATI : 6450408050

ROMBEL : 01

TUGAS MIKROBIOLOGI
SOAL
1. Jelaskan isolasi dan kultur : y y y Metode agar cawan dengan goresan atau streak plate. Metode agar tuang atau pour plate Metode cawan sebar atau sperd plate

JAWAB :  TEKNIK STREAK PLATE

Isolasi pada agar cawan Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuang Teknik streak plate (lempeng gores) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur bakteri. Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum ose. Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel.

Cara Kerja : a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke

bagian lup (ujung) sampai berpijar merah. c) Bakar bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api. d) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen. e) Bagi tiga bidang permukaan atas cawan petri yang akan distreak dengan spidol atau lainnya. f) Streak ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores. g) Arah streak pada permukaan agar menurut pembagian bidang tadi. Kemudian inkubasi dan amati koloninya.

 TEKNIK POUR PLATE Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung kolonikoloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan. Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuangMetode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel.Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan.

Atau Teknik pour plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Cara Kerja : a) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki. b) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. c) Pipet larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri. d) Tuang media agar yang masih cair (suhu + 50oC) ke dalam cawan petri tadi. e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.

 TEKNIK SPREAD PLATE Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar . Cara Kerja 1 : (dengan pipetting)

a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki. c) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. d) Pipet larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri. e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja untuk meratakan larutan dilusi tadi di atas permukaan media agar. f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri. Cara Kerja 2 : (dengan swab/apus) a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki. c) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. d) Masukkan swab stick (tangkai apus) steril ke dalam tabung reaksi hingga bagian kapasnya tenggelam di dalam larutan dilusi. Usahkan memasukkan tangkai apus jangan sampai menyentuh dinding tabung reaksi. e) Apus ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan secara merata. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores. f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.

SOAL
2. Teknik pewarnaan pada mikroba : y Pewarnaan sederhana y Pewarnaan diferensial y Pewarnaan khusus

JAWAB :
Pewarnaan sederhana - pewarnaan positif - pewarnaan negatif Pewarnaan diferensial - pewarnaan gram Pewarnaan khusus - pewarnaan endospora

 Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Cara Kerja : Bersihkan object glass dengan kapas Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali) Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik. Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue

 Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10). Atau Cara Kerja yang Lain : - warnai smear 3 4 menit dengan salah satu larutan zat warna untuk metode pewarnaan sederhana. - cuci preparat dengan air kran mengalir - Keringkan di udara (jangan dilidahapikan pada bunsen) - Periksa di bawah mikroskop cahaya: * Pertama pakailah lensa okuler 10 dan lensa objektif 10 untuk melokalisasi bagian smear yang baik (tidak tebal, sel-sel bakteri tidak bertumpuk atau bertindihan) * tetesi imersion oil bagian smear yang baik tersebut * pakailah lensa objektif 100 untuk mengamati sel-sel bakteri.

Pewarnaan Negatif

Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Prosedur: Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri. Atau Cara yang Lain : - Suspensi bakteri dicampur dengan larutan zat warna sama banyak (masing-masing 1 lop penuh) pada permukaan sebuah objek gelas yang bersih dan kering, ratakan sehingga menjadi smear yang tipis. - keringkan di udara dan selajutnya periksa di bawah mikroskop cahaya seperti tersebut di atas.

 Teknik pewarnaan diferensial Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna

yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. atau Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.

Pewarnaan Gram

Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb: Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CViodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan

CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. PROSEDUR Pewarnaan gram - warnai smear selama 1 menit dengan larutan ammonium oksalat kristal violet - cuci dengan air kran mengalir 2 detik - celupkan 1 menit dalam larutan lugol - cuci dengan air kran mengalir dan lap kering - lunturkan setengah menit di dalam alkohol 95% dengan agitasi perlahan-lahan dan lap kering - counterstain 10 detik dalam larutan safranin - cuci di air keran mengalir - keringkan dan periksa di bawah mikroskop cahaya seperti tercantum pada pewarnaan sederhana

 Pewarnaan Khusus

( BELUM)
Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur

pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton.