LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KULTUR Mycobacterium tuberculosis.

OLEH :
DIV ANALIS KESEHATAN
KELOMPOK B1
SEMESTER IV
1. Aeni Halawiya
2. Ahmad Busyairi Asgar
3. Buana Putri Ayu
4. Esti Amelia Utari
5. Ikrimatul Ismi
6. Intan Permata Sari
7. Isnani Astaning Haq
8. Kurratun Israni
9. Lalu Nugraha Saputra
10. Maulia Hardian Hayati
11. Ni Kadek Ayu Sawitri
12. Nurfemi Setiawati

13. Pradini Restu Wiriantini

14. Putu Desy Anggraeni
15. R. Rian Jayakusuma
16. Rizkika Ariyani Sulthani
17. Rani Mardiyanti Hastri
18. Silvi Mahelga
19. Tyas Jumratul Aiman
20. Ummu Fatihah Ammutamima
21. Yossy Pahlevi Defanti
22. Yunita Astarini
23. Yuyun Sukma

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN

ANALIS KESEHATAN
MATARAM
2015 / 2016

Kultur Mycobacterium tuberculosis

I. TUJUAN

Mahasiswa mampu melakukan kultur bakteri Mycobacterium tuberculosis dari

sampel sputum dengan benar.

Mahasiswa mampu mempersiapkan alat, bahan, media dan reagen untuk

melakukan kultur Mycobacterium tuberculosis

Mengetahui morfologi dan sifat biakan bakteri Mycobacterium tuberculosis

II. PRINSIP KERJA

Prinsip Kultur Mycobacterium tuberculosis
Sampel sputum disuspensikan dengan larutan NaOH 4% dan disentrifuge pada
kecepatan 3000 rpm selama 10 menit (dilakukan sebanyak 3 kali). Diambil pellet yang
terbentuk dan dibuat preparat, dicat dengan pewarnaan ZN. Jika hasil negatif BTA,
pemeriksaan dihentikan, dan bila hasil positif BTA, dilanjutkan ke penanaman pada
media LJ. Amati pertumbuhan koloni setiap 3 hari sekali selama 4 minggu. Jika
terdapat pertumbuhan koloni di bawah sepuluh hari, koloni tersebut menunjukkan
Mycobacterium tuberculosis nonpathogen. Bila pertumbuhan koloni di atas sepuluh
hari, koloni tersebut menunjukkan Mycobacterium tuberculosis patogen dan
dilanjutkan pengecetan ZN.

Prinsip Pewarnaan Ziehl Neelson

Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar

ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan
lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan
lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol
warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan
mengambil warna biru dari methylen blue.
III.

LANDASAN TEORI
Mycobacterium adalah genus dari Actinobacteria. Genus ini mencakup bakteribakteri patogen yang diketahui menyebabkan penyakit serius pada mamalia, termasuk
tuberkulosis (Mycobacterium tuberculosis) dan kusta (Mycobacterium leprae).(Jawets,
Melnick, Adleberg : 2005)
Dalam jaringan, Mycobacterium berbentuk batang lurus, tipis dengan morfologi
yang beragam antara satu spesies dengan spesies yang lain. Mycobacterium tidak dapat
diklasifikasikan sebagai bakteri gram positif atau negatif tetapi merupakan Bakteri

Tahan Asam karena warnanya tidak luntur oleh alkohol asam. (Jawets, Melnick,
Adleberg : 2005)
Mycobacterium adalah bakteri aerob obligat. Meningkatnya kadar CO2
meningkatkan pertumbuhannya. Meski demikian, tingkat pertumbuhannya lebih
lambat dibandingkan kebanyakan bakteri. Bentuk saprofit cenderung tumbuh lebuh
cepat dibandingkan bentuk patogen. (Jawets, Melnick, Adleberg : 2005). Pertumbuhan
dari Mycobacterium tuberculosis (patogen) relatif lambat, yaitu waktu generasi dan
waktu kemunculan koloninya sekitar 2 sampai 6 minggu. Sedangkan Mycobacterium
saprofit dapat tumbuh pada waktu 10 hari.
Mycobacteria kaya akan lipid, yaitu asam mycolat, lilin, dan fosfatida. Sebagian
besar lipid terikat dengan protein dan polisakarida. Sampai batas tertentu, lipid
melindungi dinding sel mycobacteria sehingga tahan terhadap asam. Protein dalam
dinding sel mycobacteria menimbulkan pembentukan berbagai antibodi sedangkan
polisakarida berfungsi sebagai antigen dalam reaksi dengan serum orang yang
terinfeksi. (Jawets, Melnick, Adleberg : 2005)
Mycobacterium cenderung lebih tahan terhadap bahan kimia dari bakteri lain
karena sifat hidrofobik permukaan sel. Asam dan basa memungkinkan kelangsungan
hidup beberapa basil tuberkulosis dan digunakan untuk membantu menghilangkan
kontaminan. Selain itu, basil tuberkulosis tahan terhadap pengeringan sehingga
bertahan untuk yang lama dalam dahak kering. (Jawets, Melnick, Adleberg : 2005)

IV.

ALAT, BAHAN, REAGEN DAN MEDIA

Alat:
1. Oven
10. Bak pengecatan
2. Inkubator
11. Lampu spiritus
3. Autoclave
12. Batang pengaduk
4. Mikroskop
13. Pecahan kaca
5. Sentrifuge
14. Pipet tetes
6. Beker gelas
15. Mikropipet + tip
7. Erlenmeyer
16. Lidi yang bagian ujungnya dipipihkan
8. Gelas ukur
17. Objek gelas
9. Tabung reaksi + rak
18. Cawan Petri (plate)

Bahan:
1. Telur bebek
2. Sampel sputum
3. Aquadest
4. Pasir
5. Oil imersi

Reagen:
1. PZ
2. NaOH 4%
3. Gliserol
4. Alkohol 70%
5. Cat ZN A (Carbol Fuchsin)
6. Cat ZN B (asam alkohol)
7. Cat ZN C (methylen blue 0,3%)

Media:
Media Lowenstein Jensen
Asparagine

3,60 g

Monopotasium phosphate

2,50 g

Magnesium citrate

0,50 g

Magnesium sulfate

0,24 g

Potato flour

30,00 g

Malasit green

0,40 g

Egg (fresh,whole)

1000,00 ml

Glyserol

12,00 g

Aquadest

600,0 ml

V. SKEMA KERJA
SAMPEL
SPUTUM

CAT Ziehl
Neelson

KONSENTRASIK
AN

CAT Ziehl
Neelson

(+)

(-)

DITANAM DI
MEDIA L J

STOP

KOLONI
TUMBUH < 10
HARI

KOLONI
TUMBUH > 10
HARI

Mycobacterium
non patogen

Mycobacterium
patogen

CAT Ziehl
Neelson
KESIMPULAN

VI.

CARA KERJA
Pembuatan Media Lowenstein Jensen

Preparasi Telur:
1. Dicuci 2 buah telur bebek hingga bersih.
2. Direndam telur dalam alkohol 70 % selama 15 menit kemudian dikeringkan.
3. Dimasukkan pecahan kaca yang sudah disterilisasi ke dalam erlenmeyer.
4. Dimasukkan dengan hati-hati kuning telur dan putih telur ke dalam erlenmeyer
yang berisi pecahan kaca.
5. Digoyangkan atau homogenkan putih telur dan kuning telur secara perlahan.
Dijaga jangan sampai terjadi gelembung.

Pembuatan Media Lowenstein Jensen:

1. Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan.
2. Ditimbang media LJ sebanyak 1,875 gram.

3. Dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer yang telah berisi aquadest setengah

4.
5.
6.
7.

volume yang diinginkan.

Dihomogenkan dan ditambahkan gliserol sebanyak 12 ml.
Diaddkan dengan aquadest hingga 30 ml lalu dihomogenkan.
Ditutup mulut erlenmeyer dengan kapas.
Disterilkan pada autoclave dengan suhu 121C selama 15 menit pada

tekanan 1 atm.
8. Ditambahkan telur bebek yang telah dipreparasi sebanyak 50 ml ke dalam
media LJ (setelah media bersuhu 500C). Dilakukan secara aseptik.
9. Dikocok hingga homogen dengan hati-hati dan dijaga agar tidak terbentuk
gelembung.
10. Dipanaskan mulut erlenmeyer lalu dituangkan media tersebut ke dalam tabung
bertutup kapas sebanyak 5 ml. Dilakukan secara aseptik.
11. Dilakukan tindalisasi pada suhu 85C selama 60 menit dengan kemiringan
30. Tindalisasi dilakukan selama 3 hari berturut-turut pada oven.
Hari Pertama
A. Pembuatan Sediaan Sputum
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dimbil objek gelas yang bersih dan dibebaskan dari lemak dengan cara
memanaskan di atas nyala api.
3. Diambil sampel sputum dengan menggunakan lidi yang telah di pipihkan
bagian ujungnya, kemudian diletakkan pada kaca sediaan.
4. Diratakan sputum dengan cara membuat pola spiral yang kecil-kecil dengan
ukuran diameter 2-3 cm.
5. Dikeringkan sediaan pada suhu kamar (jangan dikeringkan di atas nyala
api).
6. Setelah benar-benar kering, sediaan difiksasi diatas nyala api sebanyak 3x
selama 3-5 detik.
7. Sediaan siap diwarnai.
B. Pewarnaan Sediaan Sputum Metode Ziehl Neelson
1. Dibuat sediaan sputum diatas objek glass dengan ukuran 3x2cm.
2. Diletakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan menghadap ke
atas.
3. Dituangkan cat ZN A (Carbol Fuchsin) sampai menutupi seluruh permukaan
sediaan
4. Dipanaskan sediaan secara hati-hati dengan melewatkan nyala api pada
bagian bawah kaca sediaan selama 3 menit (sampai keluar uap) dan jangan
sampai mendidih. Sediaan dibiarkan hingga dingin selama 5 menit.
5. Dicuci sediaan dengan air mengalir.

6. Dituangkan ZN B (asam alkohol) di atas sediaan sampai warna merah dari

fuchsin hilang.
7. Dicuci sediaan dengan air mengalir.
8. Dituangkan larutan ZN C (methylen blue 0,3%) diatas sediaan dan
dibiarkan selama 30 detik sampai 1 menit.
9. Dicuci sediaan dengan air mengalir dan dikeringkan pada suhu kamar.
10. Diamati sediaan dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 100x
dengan oil imersi.
C. Konsentasi Sampel Sputum
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Disuspensikan sampel sputum dengan NaOH 4% dengan perbandingan 1:1.
3. Disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10-15 menit.
4. Dibuang supernatan menggunakan pipet tetes, kemudian endapannya
disuspensikan kembali menggunakan NaOH 4 %.
5. Dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali.
D. Dilakukan

pewarnaan

Ziehl

Neelson

dari

sampel

yang

sudah

dikonsentrasikan:
1. Diambil sampel yang telah dikonsentrasikan dengan menggunakan lidi yang
telah dipipihkan bagian ujungnya kemudian diletakkan diatas objek glass
yang bersih dan bebas dari lemak.
2. Sediaan dibuat menyerupai bentuk spiral yang kecil-kecil dengan ukuran
diameter 2-3 cm, kemudian ditunggu kering dan difiksasi di atas nyala api.
3. Diletakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan menghadap ke atas
4. Dituangkan cat ZN A (Carbol Fuchsin) sampai menutupi seluruh permukaan
sediaan
5. Dipanaskan sediaan secara hati-hati dengan melewatkan nyala api pada
bagian bawah kaca sediaan selama 3 menit (sampai keluar uap) dan jangan
sampai mendidih. Sediaan dibiarkan hingga dingin selama 5 menit.
6. Dicuci sediaan dengan air mengalir.
7. Dituangkan ZN B (asam alkohol) di atas sediaan sampai warna merah dari
fuchsin hilang.
8. Dicuci sediaan dengan air mengalir.
9. Dituangkan larutan ZN C (methylen blue 0,3%) diatas sediaan dan dibiarkan
selama 10-20 detik.
10. Dicuci sediaan dengan air mengalir dan dikeringkan pada suhu kamar.
11. Diamati sediaan dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 100x
dengan oil imersi

E. Kultur Mycobacterium tuberculosis pada media Lowenstein Jensen

1. Sampel sputum (yang telah dikonsentrasikan) yang dinyatakan positif (+)
BTA dilanjutkan dengan penanaman pada media Lowenstein Jensen dengan
mengalirkan 100 l sampel pada permukaan media (dari bagian lereng ke
dasar tabung media).
2. Diinkubasi pada suhu 370C. Dan dilihat pertumbuhan koloni bakteri tiap 3
hari dan dilakukan pewarnaan Zeihl Neelson setelah lebih dari 10 hari.

VII.

INTERPRETASI HASIL
A. Pembacaan sediaan BTA
Berikut interpretasi hasil berdasarkan skala IUATLD (International Union Against
Tuberculosis and Lung Diseases).
1. Negatif ()
: Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapang pandang.
2. Positif (+)
: Ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang (ditulis
sesuai jumlah kuman yang ditemukan).
3. Positif (+1)
: Ditemukan 10-99 BTA dalam 100 lapang pandang.
4. Positif (+2)
: Ditemukan 1-9 BTA pada 1 lapang pandang.
5. Positif (+3)
: Ditemukan >10 BTA dalam 1 lapang pandang.
B. Media Lowenstein Jensen
Didapatkan pertumbuhan koloni dengan ciri-ciri koloni berwarna krem,
permukaannya tidak rata atau berdungkul-dungkul seperti bunga kol kering.
Berikut interpretasi hasil berdasarkan jumlah koloni :
1. Negatif (): Tidak ditemukan koloni pada media.
2. Positif (+) : Ditemukan 1-19 koloni pada media (ditulis sesuai jumlah
3.
4.
5.
6.

koloni).
Positif (+1): Ditemukan 20-100 koloni pada media.
Positif (+2): Ditemukan 100-200 koloni pada media.
Positif (+3): Ditemukan 200-500 koloni pada media.
Positif (+4): Ditemukan >500 koloni pada media.
Pertumbuhan koloni < 10 hari : Mycobacterium tuberculosis
nonpathogen.
Pertumbuhan koloni > 10 hari : Mycobacterium tuberculosis pathogen.
Koloni positif
: Menyerupai kembang kol berwarna krem.
Koloni negative : Tidak terdapat koloni menyerupai kembang kol
berwarna krem

VIII. HASIL
1. Pembuatan Preparat Mycobacterium tuberculosis
N

GAMBAR

O
1.

SYARAT
Preparat

dibuat

dengan

diameter kurang lebih 2-3

cm, dan tidak terlalu tebal
dan tidak terlalu tipis.
2. Pemeriksaan Mikroskopis Preparat Positif
Hasil pengecetan dengan pewarnaan Ziehl Neelsen :
a. Bentuk
: Batang tidak beraturan
b. Warna
: Merah (Tahan Asam)
c. Susunan
: Monobasil, diplobasil, streptobasil
d. Latar Belakang
: Biru
HASIL
Preparat

GAMBAR

KETERANGAN
Bernilai

positif

dengan ditemukannya
> 10 BTA dalam 100
LP.
banyak

Ditemukan
BTA

pada

masing-masing LP.
Tanda

panah

di

samping
menunjukkan
tuberculosis.

M.

3. Pemeriksaan Pertumbuhan Koloni pada Media Lowenstein Jensen (LJ)

Berdasarkan hasil penanaman sampel pada medi Lowenstein Jensen (LJ),
didapatkan hasil sebagai berikut :
PENGAMATAN

GAMBAR

KETERANGAN

3 Hari Pertama

Terdapat

pertumbuhan

bakteri dengan ciri-ciri

koloni berwarna krem,
permukaannya tidak rata
atau berdungkul-dungkul
seperti bunga kol kering.

4. Pemeriksaan Mikroskopis Setelah Lebih dari 10 Hari

Berdasarkan hasil pewarnaan Ziehl Neelson pada koloni yang tumbuh lebih dari 10
hari pada media Lowenstein Jensen tidak ditemukan adanya BTA.
GAMBAR

KETERANGAN
Hasil negatif (-) tidak ditemukan adanya BTA
dalam 100 lapangan pandang.

IX.

PEMBAHASAN
Mycobacterium

tuberculosis

adalah

kelompok

bakteri

di

dalam

family

Micobacteriaceae dan ordo Actinomycetales dan genus Micobacterium. Bakteri ini

penyebab penyakit tuberculosis, bersifat tahan asam dan sukar diwarnai. Berbentuk batang
lurus dengan panjang 1-4 um dan lebar antara 0,2-0,5 um. Pewarnaan yang berguna untuk
melihat morfologi bakteri ini adalah pewarnaan tahan asam, misalnya pewarnaan Zeihl
Neelsen ataupun Kinyon Gabbet.
Lowenstein-Jensen merupakan media yang duigunakan untuk menumbuhkan
Mycobacterium tuberculosis. Pada media ini menggunakan malasit green untuk
menghambat bakteri lain kemudian memodifikasi dengan citrate dan phosphate. Komposisi
dari asam fatty dan protein esensial untuk metabolism bakteri. Glyserol bersumber dari
carbon dan energi yang dibutuhkan untuk type human tubercle bacillus daripada bovine
type. Namun, pada praktikum ini terjadi kesalahan pada saat penambahan glyserol. Dimana
glyserol ditambahkan setelah distrerilisasi yang seharusnya ditambahkan sebelum
dilakukan sterilisasi. Kemudian pada media juga dilakukan penambahan telur. Albumin
dari telur tersebut sebagai asparagin dan RNA untuk menyediakan sumber nitrogen dan
stimulant pertumbuhan coagulasi. Setelah semua komposisi media dimasukkan dan
dihomogenkan media kemudian ditindalisasi atau pemanasan bertingkat yang bertujuan
untuk memadatkan media tersebut karena pada media Loewenstein Jensen tidak dilakukan
penambahan agar.
Morfologi koloni Mycobacterium tuberculosis pada media Loewenstein Jensen adalah
sebagai berikut: kasar, kering, rapuh, tengah bertumpuk dengan tepi berjejas tipis; kadangkadang tipis dan menyebar. Hari tumbuh 12 28 hari dan tidak berpigmen baik pada
tempat yang terang maupun gelap (buff).
Pada hari pertama dilakukan pewarnaan dari sampel langsung dengan pengecatan
Ziehl Neelson. Dan didapatkan Bakteri Tahan Asam (Basil )berbentuk batang tidak
beraturan dengan warna dasar biru dan warna kuman merah pink. Kemudian sampel
tersebut dilakukan konsentrasi yang berfungsi untuk memisahkan bakteri dari bahan
bahan lain dengan cara sentrifugasi. Maka akan didapatkan suspensi bakteri pada pelet
hasil sentrifugasi dan bagian supernatannya dibuang.
Pada hari kedua dilakukan tindalisasi tahap pertama terhadap media Loweinstein
Jensen. Proses tindalisasi ini dilakukan sampai pada hari keempat. Kemudian pada hari
kelima dilakukan penanaman hasil konsentrasi sampel pada media Loweinstein Jensen
yang sudah ditindalisasi. Setelah dilakukan penanaman, media Loweinstein Jensen

diinkubasi pada suhu 37o C, dan dilakukan pengamatan pada setiap tiga hari. Karena untuk
Mycobacterium Tuberculosis patogen akan tumbuh pada hari ke 12-28 . Sedangkan pada
strain non patogen akan tumbuh pada 3 hari pertama.
Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan, bakteri tumbuh pada hari ketiga
pertama, kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan Ziehl Neelson selanjutnya diamati di
bawah mikroskop perbesaran 100x lensa objektif dengan oil imersi. Setelah diamati di
bawah mikroskop didapatkan hasil negatif. Dari hasil pengamatan pada 100 lapangan tidak
ditemukan adanya BTA. Jadi dari hasil praktikum ini tidak ditemukan adanya
Mycobacterium tuberculosis (patogen) dari hasil penanaman pada media Loewenstein
Jensen. Hal ini terjadi diakibatkan kesalahan pada saat pembuatan media Loewenstein
Jensen, dimana penambahan glyserol tidak dilakukan sebelum sterilisasi yang
menyebabkan glyserol menjadi tidak steril. Akibatnya dihasilkan media yang kondisinya
kurang sesuai untuk pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis (patogen). Tetapi dari ciriciri pertumbuhan bakteri yang didapatkan yaitu positif BTA pewarnaan di hari pertama dan
tumbuhnya koloni bakteri setelah 3 hari pertama menunjukkan bahwa bakteri yang tumbuh
pada media Loewenstein Jensen merupakan bakteri Mycobacterium non patogen.
X. KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa jenis bakteri
yang dikultur pada media Loewenstein Jensen setelah dilakukan pemeriksaan kembali
setelah lebih dari 10 hari yaitu berupa bakteri Mycobacterium non patogen

DAFTAR PUSTAKA
Central TB Division. 2009. Revised National TB Control Programme Training Manual for
Mycobacterium tuberculosis Culture & Drug susceptibility testing. Directorate General of Health
Services. New Delhi. Hal.17. Available as PDF file.
Mansjoer A, Triyanti K, Savitri R, Wardhani WI, dan Setiowulan W. 2000. Kapita Selekta
Kedokteran. ed.3. MedIa Aesculapius. Jakarta. Hal. 472-475. 5.Departemen Ksehatan RI. 2008.
Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis. ed. 2. Jakarta. Hal 3-36.
Anonim. 2013. Preparat Pengecatan BTA. http://aallaammaatt.blogspot.co.id/2013/04/preparatpengecatan-bta.html. Diakses tanggal 17 mei 2016.
Anonim.

Pewarnaan

BTA

Zeihl

Neelsen.

http://analiskesehatanmakassar.blogspot.co.id/2010/04/pewarnaan-bta-zeihl-neelsen.html. Diakses
tanggal 17 mei 2016.
Octaviana,

Ageha

L.

Lowenstein

Jensen

atau

Kudoh.

http://kuuiposaranghada.blogspot.co.id/2011/04/lowenstein-jensen-atau-kudoh.html.

Diakses

tangga 18 mei 2016.

Mataram, 20 Mei 2016

Dosen Pembimbing,

Praktikan,

(Lalu Srigede, S.Si, M.si)

(kelompok B1)