LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI LINGKUNGAN

IDENTIFIKASI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

DISUSUN :
NAMA : UTIN RACHMINI
NIM : 20184323070
TINGKAT : 3

POLTEKKES KEMENKES PONTIANAK

PROGRAM STUDI SARJANA TERAPAN
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
Hari/tanggal : Senin, 5 September 2020

Judul : Identifikasi Mycobacterium Tuberculosis

Tujuan : Untuk mengetahui jenis sampel yang digunakan identifikasi Mycobaktrium
Tuberkulosis

Untuk mengetahui cara pengambilan sampel pada penderita Mycobaktrium

Tuberkulosis

Untuk mengetahui persiapan peralatan dan bahan / media dan reagens yang
diperlukan untuk identifikasi Mycobaktrium Tuberkulosis

Untuk mengetahui prosedur kerja identifikasi Mycobaktrium Tuberkulosis

Untuk mengetahui pembacaan hasil pertumbuhan Mycobaktrium Tuberkulosis

pada media

Untuk mengetahui membuat lapran hasil idnetifikasi Mycobaktrium

Tuberkulosis

Prinsip : Bakteri atau sampel ditanam pada media kemudian dilakukan pewarnaan dan
dilakukan identifikasi terhadap sampel untuk mendapatkan ciri spesifik dari
bakteri Mycobacterium tuberculosis.

Dasar Teori :
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit melengkung, tidak berspora dan
tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran lebar 0,3 – 0,6 mm dan panjang 1 – 4 mm. Dinding
Mycobacterium tuberculosis sangat kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%).
Penyusun utama dinding sel Mycobacterium tuberculosis adalah asam mikolat merupakan asam
lemak berantai panjang yang dihubungkan dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid dan
peptidoglikan oleh jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri
tersebut adalah polisakarida. Struktur dinding sel yang kompleks tersebut menyebabkan bakteri
Mycobacterium tuberculosis bersifat tahan asam, yaitu apabila sekali diwarnai akan tahan
terhadap upaya penghilangan zat warna tersebut dengan larutan asam-alkohol. Mycobacterium
tuberculosis mempunyai sifat khusus yaitu tahan terhadap asam pada pewarnaan Zielh-Nelssen,
oleh karena itu disebut pula Basil Tahan Asam (BTA). Bakteri ini cepat mati dengan sinar
matahari langsung, tetapi dapat hidup beberapa jam ditempat yang gelap dan lembab.
Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri aerob obligat dan parasit intraseluler fakultatif
dan memiliki waktu generasi yang lambat antara 15-20 jam. Mycobacterium tuberculosis tidak
bisa diklasifikasikan sebagai bakteri gram positif atau gram negatif karena tidak memiliki
karakteristik kimia yang baik, meskipun bakteri ini mengandung peptidoglikan dalam dinding sel
mereka. Jika pewarnaan gram dilakukan pada Mycobacterium tuberculosis maka akan terlihat
warna yang sangat lemah pada gram positif atau tidak terlihat sama sekali. Mycobacteria
berbentuk basil, merupakan bakteri aerobik yang tidak membentuk spora. Meskipun mereka
tidak terwarnai dengan baik , segera setelah diwarnai mereka mempertahankan dekolorisasi oleh
asam atau alkohol, oleh karena itu bakteri ini dinamakan basil tahan asam. Bakteri ini biasanya
tumbuh lambat dan tidak tumbuh pada pembenihan biasa, tetapi memerlukan pembenihan yang
diperkaya dengan albumin telur misalnya dengan kultur dengan media Lowenstein Jensen.
Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberkulosis dan merupakan patogen pada manusia.
Mycobacterium avium-intraselluler dan Mycobacterium atipikal lain sering menginfeksi pasien
AIDS, bersifat patogen opportunistik pada orang immunokompromis dan kadang-kadang
menyebabkan penyakit pada pasien dengan sistem immun normal.

Alat – Alat :
- Plate - Spirtus
- Ose - Hot plate
- Objek glass - Mikroskop
- Mikroskop - Lampu Spritus
- Tabung reaksi - Pot Sputum steril,
- Rak tabung - Masker
- Erlenmeyer - Sarung Tanga

Bahan :
1. Media Lowenstein Jensen - 0,6g Tri-magnesium sitrat
- 2,4g KH2PO4 - 3,6g L-asparagin
 - 1g sodium glutamat - 2g sodium glutamat
- 6,5g sodium piruvat - 1,2 g sodium piruvat.
- 600ml aquadest - 14 g agar Noble,
- 1L whole egg - 540 ml aquadest
- 20ml malachite green 2% - 40 mL kuning telur
2. Media Ogawa - 400 ml whole egg
- 3 gr KH2PO4 - 12 mL malachite green 2%
3. Pewarna
a. Karbol Fuchsin
- Basic Fuchsin 1 gr
- Fenol kristal 5 gr
- Alkohol 96% 10 ml
- Aquadest 100 ml
b. Asam Alkohol
- HCl pekat 3 ml
- Alkohol 96% add 100 ml
c. Methylene Blue
- Methylene Blue 0,5 gr
- Aquadest add 100 ml
d. Kinyoun
- Basic Fuchsin 4 gr
- Alkohol 96% 20 ml
- Fenol Kristal 8 gr
- Aquadest add 100 ml
e. Gabbet
- Methylene blue 2 gr
- H2SO4 40 ml
- Alkohol 96% 60 ml
- Aquadest add 100 ml

Sampel Pemeriksaan :
 - Sputum / dahak
- Cairan lambung,
- Urine
- Cairan pleura
- Cairan otak dan sendi
- Bahan biopsi
- Nanah Pus
Prosedur Pemuatan Reagen, Media, Homogenisasi :
 Pembuatan Reagen
a. Karbol Fuchsin
- Larutkan karbol fuchsin 1 gr, fenol kristal 5 gr dan alkohol 96% 10 ml kedalam 100 ml
aquadest add
- Campur dan homogenkan kemudian simpan dalam botol reagen dan beri label
b. Asam Alkohol
- Larutkan HCl pekat 3 ml kedalam alkohol 96% add 100 ml
- Campur dan homogenkan,kemudian simpan dalam botol reagen dan beri label
c. Methylene Blue
- Larutkan Methylene Blue 0,5 gr kedalam aquadest add 100 ml
- Campur dan homogenkan,kemudian simpan dalam botol reagen dan beri label
d. Kinyoun
- Larutkan basic fuchsin 4 gr, alkohol 96% 20 ml, fenol kristal 8 gr kedalam aquadest add 100
ml
- Campur dan homogenkan, kemudian simpan dalam botol reagen dan beri label
e. Gabbet
- Larutkan methylene blue 2 gr, H2SO4 40 ml, akohol 60 ml kedalam aquadest add 100 ml
- Campur dan homogenkan, kemudian simpan dalam botol reagen dan beri label
 Pembuatan Media
a. Media Lowenstein Jensen
- Timbang 2,4 gr KH2PO, 0,6 gr Tri-magnesium sitrat, 3,6 gr L-asparagin, 1 gr sodium
glutamat, 6,5 gr sodium piruvat
- Larutan tersebut dilarutkan dalam aquadest hingga 600 ml
- Dihomogenkan dengan hot plate,
- Kemudian diautoklaf pada suhu 121°C selama15 menit.
- Larutan tersebut ditambah 1 L whole egg, dihomogenkan, dan diberi 20 ml malachite green
2%
b. Media Ogawa
- Timbang 3 gr KH2PO4, 2 g sodium glutamat, 1,2 g sodiumpiruvat.
- Larutan tersebut ditambah 14 g agar Noble, ditambah aquades hingga 540 mL,
- Dihomogenkan dengan hot plate
- kemudian diautoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit
- Larutan didinginkan hingga suhu 50°C,
- Dtambahkan 140 mL kuning telur dan 12 mL malachite green 2%, dihomogenkan,
- Dibagi kedalam lima tabung steril, masing-masing sebanyak 10 mL.
- Tabung diposisikan dengan kemiringan 45° sampai media menjadi padat.
- Untuk menguji sterilitasnya, media diinkuba-sikan pada suhu 37°C selama 48 jam
- Media kemudian disimpan pada suhu 4°C sebelum digunakan

 Homogenisasi Sputum dengan NaOH

- Sputum sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi,
- Kemudian ditambah 2 ml larutan NaOH 4%,
- Dikocok-kocok selama 15 menit
- Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm. selama 15 menit
- Supernatant dibuang kemudian filtrate dibuat smear dan siap untuk dilakukan pengecatan
dengan metode Ziehl Nelseen
 Proses Dekontaminasi Sputuh pada NaOH
- Siapkan sputum yang akan didekontaminasi
- Tambahkan Larutan dekontaminan (NaOH 4%, +2,9 % Na Sitrat) sebanyak 500 µL ke
dalam tabung sentrifuge yang telah berisi sputum sebanyak 500 µL.
- Campurkan / homogenisasikan tabung yang berisi cairan sputum dan NaOH 4 % diatas
mesin pengguncang (vortex shaker) dengan kecepatan 2500 rpm 20 detik.
- Sentrifuge larutan homogenisasi selama 15 menit pada kecepatan 3000 rpm. Buang
supernatan
- Tambahkan sedimen dengan larutan HCl sebanyak 100µL kemudian dihomoginesasikan
dengan menggunakan vortex shaker.
- Ambil dan pilih bagian dari dahak yang purulen yang telah didekontaminasi dengan
menggunakan ose atau lidi

Prosedur Kerja :
1. Pemeriksaan Mikroskopis
a. Metode Ziehl Neelsen
- Sediaan di genangi dengan cat Ziehl Neelsen A Karbol fuchein selama 5 menit sambil di
panaskan jangan mendidih.
- Cuci dengan air mengalir
- Tambahkan cat Ziehl Neelsen B (asam alcohol) selama 30 detik, buang
- Cuci dengan air mengalir
- Genangi dengan cat Ziehl Neelsen C (methylene blue) biarkan selama 1 menit
- Cuci dengan air mengalir.
- Keringkan sediaan pada rak pengering
- Preparat siap utk diperiksa.
- Pemeriksaan dgn mikroskop pembesaran 1000x
b. Metode Kinyoun Gabbet
- Preparat difiksasi terlebih dahulu
- Genangi preparat dengan cat Kinyoun, biarkan 3-5 menit
- Sisa cat dibuang, lalu cuci dengan air mengalur
- Genangi dengan cat Gabbet, biarkan selama 1-3 menit
- Sisa cat dibuang, cuci, kemudian dikeringkan
- Periksa dibawah mikroskop perbesaran 1000x
2. Pembiakan Pada Media
a. Media Lowenstein Jensen
- Sputum / dahak yang telah dilakukan dekontaminasi dengan NaOH 4 %.
- Kemudian Inokulasi pada media L. Jensen mengunakan ose.
- Kemudian Inkubasi pada alat inkubator pada 37⁰C selama 4-6 minggu.
- Amati pertumbuhan koloni bakteri pada media L. Jensen.
- Ciri-ciri pertumbuhan koloni, seperti bungan kol, koloni bewarna kuning keputih-putihan.
b. Media Ogawa
- Sputum / dahak yang telah dilakukan dekontaminasi dengan NaOH 4 %.
- Kemudian Inokulasi pada media Ogawamengunakan ose.
- Kemudian Inkubasi pada alat inkubator pada 37⁰C selama 4-6 minggu.
- Amati pertumbuhan koloni bakteri pada media Ogawa
- Koloni tumbuh di atas permukaan cairan biakan berwarna kuning pucat, warna media
disekitar koloni menjadi hijau tua
3. Tes Biokimia
a. Uji Niacin
- Memasukkan 2 mL akuades mendidih ke dalam media yang berisi koloni kuman
(minimal 100 koloni)
- biarkan 10 menit agar niasin terekstraksi,
- Selanjutnya cairan ekstrak dipipet 0,2 mL dan dimasukkan ke dalam tabung lain.
- Kemudian ditambahkan 0,1 mL anilin 4% 31 dalam alkohol dan 0,1 mL cyanogen
bromide 10% dalam akuades dan dicampur,
- Setelah 5 menit dibaca hasilnya
4. Tes Tuberkulin
Tes mantoux dilakukan dengan cara menyuntikkan sejumlah zat kecil cairan yang disebut
dengan PPD tuberculin, pada kulit lengan. Pasca penyuntikan, biasanya akan terbentuk
benjolan kecil di permukaan kulit. Jika tidak muncul pembesaran pada benjolan, dapat
disimpulkan bahwa hasil tes Mantoux negatif atau pasien tidak terpapar kuman TB.
Sementara, pada hasil tes yang menunjukkan penambahan ukuran benjolan, biasanya
sebanyak 5-9 mm dan terlihat adanya peradangan, ini berarti tes Mantoux dikatakan
positif, yakni pasien sedang atau sudah pernah terpapar kuman TB. Hasil tes ini
memerlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk memastikan apakah terdapat infeksi TB.
5. Tes PCR
Pada metode ini bahan pemeriksaan lebih dahulu didekontaminasi, lalu dinetralisasi,
kemudian dicuci dengan bufer dan disentrifus. Setelah supernatan dibuang, sedimennya
dibuat suspensi, lalu dilakukan ekstraksi DNA. Dari penelitian Buck et al. mendapatkan
cara ekstraksi DNA yang terbaik adalah dengan Sonication. Dengan cara ini DNA dapat
ditemukan jika dalam bahan terdapat 10 - 1000 basil; sedang dengan cara lain misal
 dengan Proteinase K, harus terdapat > 1000 basil supaya DNA dapat ditemukan. Hasil
ekstraksi kemudian dipresipitasi dengan alkohol dan presipitat yang mengandung DNA
disuspensikan dalam akuades untuk selanjutnya diperbanyak dengan PCR.

Hasil Pengamatan :
Mikroskopis

Metode Ziehl Neelsen

Mycobakterium
Tuberculosis
Berbentuk basil berwarna merah,sifat bakteri tahan asam,sedangkan sifat bakteri tidak tahan
asam berwarna biru

Media Lowenstein Jensen

Bentuk : Seperti bunga kol

Warna : Kuning keputih-putihan

Media Ogawa

Koloni berwarna kuning pucat warna koloni disekitar

media menjadi hijau tua
Uji Niasin

Koloni berwarna kuning keputihan

Tes Tuberkulin

Pembahasan :
Pemeriksaan dengan cara kultur lebih sensitif dan spesifik dibandingkan dengan pemeriksaan
sputum secara mikroskopis. Melalui pemeriksaan kultur, diferensiasi antara bakteri mati dan
hidup serta diferensiasi antara M tuberculosis. dan NTM dapat dilakukan. Selain itu pada isolat
yang ditemukan, dapat dilakukan uji kepekaan sehingga akan mampu memandu pengobatan
lebih baik. Untuk mendapatkan 50% kesempatan BTA positif diperlukan kuman BTA pada
sputum 1000 kuman per ml, sementara dengan tehnik kultur yang baik hasil positif dapat terjadi
walau kuman

hidup berkisar antara 10-100 kuman per ml. Pada pemeriksaan mikroskopis langsung, hasil
positif pada mayoritas kasus baru terjadi jika jumlah kuman per ml sputum minimal 5000
kuman, sementara untuk kultur diperlukan 1000 kuman. Pada umumnya biakan sputum akan
meningkatkan penemuan kasus sekitar 20 – 30% dari jumlah keseluruhan TB paru BTA positif.
Oleh sebab itu, pemeriksaan kultur sangat sangat bermanfaat untuk kasus paucibasile seperti
pada kasus TB ekstra paru, TB anak, dan TB sistemik (Sjahrurachman, 2008). Biakan sputum
merupakan suatu metode pemeriksaan yang kompleks, membutuhkan sarana, prasarana, dan
peralatan yang lebih mahal dan pemeriksaan mikroskopis langsung. Indikasi utama melakukan
pemeriksaan kultur apabila tiga kali BTA negatif, sedang yang bersangkutan dicurigai TB karena
mempunyai gejala saluran pernafasan, tersangka TB pada anak, spesimen berasal dari ekstra
paru, dari seorang tersangka TB, semua yang berkaitan dengan TB-HIV. Mycobacteria
merupakan mikroba tahan asam, serupa dengan rhodococcus dan Nocardia. Tingkat ketahanan
Mycobacteria terhadap asam bervariasi. Mycobacteria ada yang bersifat pathogen dan ada juga
yang tidak pathogen. Mycobacteria tidak pathogen mudah ditemukan di lingkungan manusia,
khususnya dalam air. Mycobacteria lingkungan ini merupakan cemaran yang harus diantisipasi
agar tidak mengacaukan hasil pemeriksaan kultur dan uji kepekaan. Koloni M tuberculosis yang
tumbuh pada media perbenihan mempunyai sifat tidak terjadi perubahan warna koloni setelah
terpapar cahaya, uji akumulasi niasin positif, uji reduksi nitrat positif, uji katalase tahan panas
680C negatif, dan uji PNB negatif. Jika fasilitas laboratorium tidak memadai, identifikasi M
tuberculosis minimal didasarkan pada hasil pewarnaan, kecepatan tumbuh, morfologi koloni, uji
PNB , dan salah satu uji dari niasin, reduksi nitrat, katalase tahan panas. Adapun ciri-ciri M
tuberculosa merupakan sel berbentuk batang lurus, berukuran 0,4 x 3 um. Kuman tidak berspora
dan tidak berkapsul. Pada pewarnaan ZN tampak kuman berwarna merah dengan latar belakang
biru. Pada pewarnaan fluorokrom berfluoresensi dengan warna kuning jingga. Kuman sulit
diwarnai dengan cat Gram, tapi bila berhasil maka hasilnya adalah Gram positif.
Deteksi kuman TBC dengan teknik PCR mempunyai sensitivitas yang amat tinggi. PCR
merupakan cara amplifikasi DNA, dalam hal ini DNA Mycobacterium tuberculosis, secara in
vitro. Proses ini memerlukan DNA cetakan (template) untai ganda yang mengandung DNA
target, enzim DNA polymerase, nukleotida trifosfat, dan sepasang primer. deteksi
Mycobacterium tuberculosis dilakukan dengan teknik PCR, mengingat akurasinya yang baik dan
membutuhkan waktu

pemeriksaan lebih singkat. Hasil negatif pemeriksaan BTA secara mikroskopik sebaiknya
dilanjutkan dengan teknik PCR guna menghindari salah diagnosis. Deteksi Mycobacterium
tuberculosis, baik dengan teknik PCR maupun dengan kultur bakteri secara statistik berbeda
bermakna dari deteksi BTA secara mikroskopik. Dengan demikian, Mycobacterium tuberculosis
dalam sputum sering tidak terdeteksi sebagai BTA secara mikroskopik. Pemeriksaan secara PCR
menunjukkan hasil yang berbeda yaitu penderita yang baru menjalani pengobatan ≥ 2 bulan
hasilnya masih positif dan masih ada juga penderita TB yang hampir selesai menjalani
pengobatan juga masih ditemukan positif TB paru. Oleh karena itu, PCR sangat spesifik dalam
mendeteksi Mycobacterium tuberculosis. Banyak Mycobacterium tuberculosis yang tidak
terdeteksi dengan pemeriksaan mikroskopis (BTA) dapat dideteksi dengan teknik PCR.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Irianto Koes. 2007. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung : CV. Yrama Wi
2. Gillespie, Stephen H, Kathleen B Bamford. 2007. Medical Microbiology and Infection at
Glance

Third Edition, diterjemahkan Stella Tinia H. Erlangga. Jakarta

3. Girsang, Merryani. 2013. Mycobacterium Penyebab Penyakit Tuberculosis serta Mengenai

Sifat-

sifat Pertumbuhannya di Laboratoriumí. Pusat Biomedis dan teknologi Dasar Kesehatan Badan

Litbang Kesehatan. Jakarta

PRAKTIKAN PARAF DOSEN NILAI

UTIN RACHMINI
20184323070