NAMA : Jihan Nadhira Salsabila

NIM : 20184323033
PRODI : DIV Analis Kesehatan
TINGKAT/SEMS : III/V

Identifikasi Corynebacterium diphtheriae

Hari/Tanggal : Rabu, 30 September 2020
Tujuan :
 Untuk mengetahui jenis sampel yang digunakan untuk identifikasi C. diphteriae
 Untuk mengetahui cara pengambilan sampel pada penderita C. diphteriae
 Untuk mengetahui persiapan peralatan dan bahan/ media dan reagensia yang
diperlukan untuk identifikasi C. diphteriae
 Untuk mengetahui prosedur kerja idntifikasi C. diphteriae
 Untuk mengetahui pembacaan hasil pertumbuhan C.diphteriae pada media
Prinsip :
Bakteri atau sampel ditanam pada media agar didapatkan ciri-ciri spesifik dari
Corynebacterium diphteriae
Dasar Teori :
Corynebacterium diphteriae adalah bakteri pathogen yang menyebabkan penyakit
difteri, yaitu penyakit yang menginfeksi saluran pernapasan, terutama bagian tonsil,
nesofaring, dan laring. Penularan difteri dapat melalui kontak hubungan dekat, melalui
batuk, atau udara yang tercemar oleh carier atau penderita yang akan sembuh. Penyakit
ini juga dijumpai pada darah padat penduduk dengan tingkat sanitasi yang rendah.
Lingkungan buruk merupakan sumber dari penularan penyakit.
C. diphteriae adalah makhluk anaerobic, fakultatif dan gram positif, ditandai dengan
tidak berkapsul, tidak berspora, tak bergerak, dan berbentuk batang dengan Panjang 1-8
µm dan lebar 0,3-0,8 µm. pada kultur, kelompok bakteri ini akan berhubungan satu
dengan yang lain dan membentuk seperti huruf Tionghoa.
Banyak strain C. diphteriae yang memproduksi racun difteri, sebuah eksotoksin,
dengan berat molekul 62 kilodalton. Ketidakaktifan racun dengan serum antiracun
merupakan dasar dalam vaksinasi antidifteri. Tidak semua strain berbahaya. Produksi
racun akan terjadi bila bakteri diinfeksi sebuah bakteriofaga.
Terdapat tiga subspecies yang dikenal, yakni C. diphteriae mitis, C. diphteriae
intermedius, dan C. diphteriae gravis. Ketiganya berbeda pada kemampuan untuk
mengubah zat gizi tertentu. Semuanya dapat menjadi berbahaya atau tidak berbahay bagi
manusia.
 Bakteri ini peka pada Sebagian besar antibiotika. Seperti penisilin, ampisilin,
sefalosporin, kuinolon, kloramfenikol, tetrasiklin, sefuroksin, dan trimet.
Persiapan Alat :
 Kapas steril (swab)
 Object glass
 Lidi
 Lampu spirtus
 Spatula
 Ose
 Mikroskop
 Plate
 Tabung reaksi
 Rak tabung
 Erlenmeyer
 Batang pengaduk
 Hotplate
Persiapan Bahan :
 Swab / hapusan tenggorokan
 Swab / hapusan hidung
 Bahan pemeriksaan lainnya harus diambil sebelum pemberian obat-obat antimikroba
yang harus segera dikirim ke laboratorium
Perispan Media :
 Media Agar Darah
 Media Telurit (Tellurite Blood Agar Base)
 Media Loeffler
Persiapan Reagensia :
 Pewarnaan Gram
Gram A
 Gentian violet = 1 gr
 Alcohol 90% = 10 ml
 Fenol kristal = 1 gr
 Aquadest = 100 ml (add)
Gram B (lugol)
 Yodium = 1 gr
 Kalium iodide = 2 gr
Gram C (asam alcohol)
 HCl pekat = 3 ml
 Alcohol 90% = 100 ml (add)
 Gram D (karbol fuchsin)
 Basic fuchsin = 1 gr
 Aquadest = 100 ml (add)
 Pewarnaan Albert
Albert A
 Toludin biru = 0,15 gr
 Malachite hijau = 0,20 gr
 Asam asetat glasial = 1 ml
 Alcohol 95% = 2 ml
 Aquadest = 100 ml
Albert B
 Iodium = 2 gr
 Kalium iodide = 3 gr
 Aquadest = 100 ml
 Pewarnaan Neisser
Neisser A
 Methylene blue = 0,1 gr
 Alcohol 95% = 2 ml
 Asam asetat glasial = 5 ml
 Aquadest = 95 ml
Neisser B
 Gentian violet = 1 gr
 Alcohol 95% = 10 ml
 Aquadest = 300 ml
Neisser C
 Crysodine = 2 ml
 Aquadest = 300 ml
Pembuatan Media & Reagensia :
 Pembuatan Reagensia
Pewarnaan Gram

a. Kristal Violet
1. Timbang kristal violet yang dibutuhkan
2. Masukkan ke dalam beaker glass
3. Larutkan dalam aquadest, aduk hingga homogen
4. Masukkan ke dalam botol gelap bertutup, beri label
b. Lugol
1. Timbang lugol yang dibutuhkan
 2. Masukkan ke dalam beaker glass
3. Larutkan dalam aquadest, aduk hingga homogen
4. Masukkan ke dalam botol gelap bertutup, beri label
c. Safranin/ karbol fuchsin
1. Timbang safranin/ karbol fuchsin yang dibutuhkan
2. Masukkan ke dalam beaker glass
3. Larutkan dalam aquadest, aduk hingga homogen
4. Masukkan ke dalam botol gelap bertutup, beri label

 Pembuatan Media
a. Media Agar Darah
1. Alat dan bahan disiapkan.
2. Bubuk media Blood Agar Base ditimbang sebanyak yang diperlukan kemudian
dimasukkan ke dalam beaker glass.
3. Dilarutkan dengan aquades pH ± 7 (netral) yang diperlukan kemudian
dihomogenkan di atas hot plate sambil diaduk.
4. Media disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
5. Media yang telah steril didinginkan hingga mencapai suhu 45-50oC.
6. Ditambahkan darah sebanyak sesuai perhitungan.
7. Media dituang ke dalam plate dan ditunggu hingga padat.
8. Setelah beku media siap digunakan.

b. Media Telurit (Tellurite Blood Agar Base)

1. Timbang serbuk Tellurite Blood Agar sesuai kebutuhan.
2. Larutkan dengan aquadest dan panaskan hingga larut.
3. Sterilkan dalam autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit.
4. Tambahkan darah yang dibutuhkan sesuai perhitungan dan Kalium Tellurite
1%.
5. Tuang ke dalam cawan petri secara aseptis.

c. Media Loeffler
1. Campurkan 8,75 gram dalam 250 ml air suling.
 2. Larutkan media dan sterilkan dengan autoklaf pada suhu 115 ° C selama 20
menit.
3. Dinginkan hingga 50-55 ° C dan secara aseptik tambahkan 750 ml serum
steril.
4. Aduk rata dan keluarkan secara aseptik ke dalam tabung steril.
5. Sterilkan media dengan inspeksi pada suhu 80-85 ° C selama 2 jam dalam uap
yang mengalir bebas setidaknya selama 3 hari berturut-turut.
6. Sebelum inokulasi, biarkan media pada suhu kamar.
7. kemudian langsung dilakukan inokulasi pada media.
8. Inkubasi secara aerob pada suhu 35ºC. hingga 4 hari.
9. Amati setiap hari untuk morfologi kolonial khas
10. Lakukan pewarnaan untuk memeriksa adanya bakteri C. diphtheriae dan
tampilan yang menunjukkan pembentukan sel huruf Cina.
11. Identifikasi pasti C. diphtheriae dilakukan dengan melakukan uji biokimia dan
toksigenitas.
Prosedur Kerja :
 Pewarnaan Gram
1. Buat apusan dari kultur pada kaca objek bersih menggunakan ose
2. Fiksasi di atas nyala api
3. Warnai dengan kristal violet (gram a) selama 1 menit kemudian cuci dengan air kran
4. Tetesi lugol (gram b) dan diamkan selama 1 menit kemudian cuci dengan air kran
5. Tetesi asam alcohol (gram c) selama 20-30 detik kemudian cuci dengan air kran
6. Warnai dengan karbol fuchsin/safranin (gram d) selama 1 menit
7. Cuci dengan air kran kemudian keringkan
8. Tetesi dengan oil imersi, periksa dengan mikroskop
9. Amati bentuk, warna, dan susunan dari bakteri yang dilihat

 Pewarnaan Granula Metode Albert

1. Pada sediaan yang telah difiksasi, tetesi dengan larutan albert 1. Diamkan selama 5
menit
2. Buang kelebihan pewarna, tambahkan larutan albert 2 dan diamkan selama 1 menit
3. Cuci dengan air menggunakan pipet tetes kemudian keringkan dengan menggunakan
tissue
4. Amati dengan mikroskop

 Pewarnaan Granula Metode Neisser

1. Pada sediaan yang telah difiksasi, tetesi dengan larutan Neisser A+B. diamkan selama
1-2 menit
2. Keringkan dengan tissue
3. Tetesi dengan larutan Neisser C. diamkan selama 1 menit
 4. Keringkan dengan tissue/kertas isap
5. Amati dengan mikroskop

 Uji Biokimia
Koloni tersangka yang tumbuh pada media Agar Telurit ditanam pada media glukosa
dan sukrosa (atau bisa pula ditambahkan dengan ditanam pada amylum), kemudian
diinkubasi pada suhu 37˚ C selama 24 jam.

 Uji Virulensi
Tes virulensi dilakukan untuk mengetahui apakah suatu jenis Corynebacterium
diphtheriae dapat membuat toksin difteria atau tidak. Maka untuk mengetahuinya
digunakan dua macam tes yaitu tes virulensi in vivo dengan binatang percobaan dan
tes virulensi in vitro pada lempeng agar.
a. In Vivo, dengan cara menyuntikkan suspensi bakteri yang berhasil diisolasi pada
hewan percobaan. Cara kerja tes virulensi in vivo yaitu : -
1. Tanamlah kedua kuman yang diperiksa pada tabung agar miring Loeffler pada
37˚ C selama 24 jam. Buatlah suspensi kuman tersebut di dalam 3-5 mL kaldu.
2. Ambil dua marmot (A dan B) dengan berat badan kira-kira 250 gram.
Cukurlah rambut pada masing-masing marmot pada satu sisi.
3. Suntikanlah 500 satuan antitoksin difteria pada marmot A sebelum 12-24 jam
tes dimulai. - Suntikanlah 0,1-0,2 mL suspensi kuman pada sisi yang telah
dicukur.
4. Setelah 3-4 jam, suntikanlah 30-50 satuan antitoksin difteria pada marmot B
untuk mencegah kematian binatang percobaan.
5. Bila kuman yang diperiksa adalah pembentuk toksin maka marmot A tidak
akan memperlihatkan reaksi apapun pada tempat penyuntikan. Sedangkan,
marmot B akan mendapatkan eritema pada tempat penyuntikan setelah 24 jam
disuntik. Eritema akan menjadi nekrotik setelah 2-3 hari.

b. In Vitro merupakan Tes Elek-Ouchterlony (gel difusi dari Elek) dimana kertas
saring yang dimasukkan ke dalam media (campuran proteosa pepton agar, Tween
80, gliserol, asam kosamino dan kalium tellurit) telah dicelupkan ke dalam
antitoksin Corynebacterium diphtheriae. Bakteri yang akan diperiksa ditanam
menyilang atau tegak lurus terhadap kertas saring. Lalu diinkubasi pada suhu 37˚
C selama 24 jam untuk difusi. Jika bakteri membentuk toksin difteria, maka akan
12 terbentuk garis presipitasi pada tempat pertemuan antara toksin dan antitoksin.

Hasil :
a. Pengamatan Mikroskopis

Pegamatan Pewarnaan Granula Pewarnaan

Albert Neisser Gram
Bentuk Batang Batang Batang
Warna batang Biru Kuning Ungu, Gram (+)
Kehijauan Coklat
Granuler Biru Tua Biru Tua / -
Ungu
 Susunan Seperti huruf cina atau Tersebar
membentuk huruf V, L, T

Gram Neisser

Albert

b. Uji Biokimia

Spesies Glukosa Sukrosa Amylum

Corynebacterium

Corynebacterium diphtheriae + - +
Tipe gravis
Corynebacterium diphtheriae + - -
Tipe mitis
Corynebacterium diphtheriae + - -
Tipe intermedius
Corynebacterium xerosis + + -

Corynebacterium _ - -
pseudodiphteriricum

Pembahasan :
 Berdasarkan hasil pemeriksaan pada bakteri Corynebakterium difhteri dapat diketahui
bahwa dalam pemeriksaan Corynebakterium difhteri memiliki beberapa tahap identifikasi
yaitu

• Pemeriksaan mikroskopik

• Pembiakan atau isolasi,

• Uji biokimia dan  Uji Virulensi

Tes virulensi dilakukan untuk mengetahui apakah suatu jenis Corynebacterium

diphtheriae dapat membuat toksin difteria atau tidak. Maka untuk mengetahuinya digunakan
dua macam tes yaitu tes virulensi in vivo dengan binatang percobaan dan tes virulensi in vitro
pada lempeng agar.

Kemudian untuk mengidentifikasi morfologi bakteri Corynebakterium difhteri dapat

dilakukan Pewarnaan Gram, Pewarnaan Albert dan Pewarnaan Neisser. Pada pewarnaa gram
bakteri C.difteri Gram Positif ( + ) Bewarna Ungu dan Morfologi batang bergranula . pada
pewarnaan Neisser ditemukan Poolkarrelnya ungu kehitaman Granula bewarna biru violet
( meta chromatis ) dan Badan bakteri bewarna coklat muda atau kekuningan . kemudian yang
terakhir pada pewarnaan Albert ditemukan granula hitam dan badan bewarna merah pada
bakteri Corynebakterium difhteri.

Daftar Pustaka :
 https://id.wikipedia.org/wiki/Corynebacterium_diphtheriae
 http://wiwinnurhaliza6.blogspot.com/2016/05/morfologi-dan-identifikasi-kuman.html
 https://www.infolabmed.com/2018/09/pewarnaan-corynebacterium-diphtheriae-
metode-albert.html
 https://microbenotes.com/loeffler-medium/
 Power point mata kuliah bakteriologi 3