NAMA : Jihan Nadhira Salsabila

NIM : 20184323033
PRODI : DIV Analis Kesehatan
TINGKAT/SEMS : III/V

Antimicrobial Susceptibility Testing (AST) atau Pemeriksaan Pengaruh

Antimikroba dengan Metode Difusi Kirby-Bauer

Hari/Tanggal : Rabu, 2 Desember 2020

Tujuan : Mengetahui cara persiapan dan prosedur pemeriksaan AST metode
difusi
Prinsip :
Sejumlah bakteri dengan konsentrasi tertentu ditanamkan pada media agar plate
dimana terdapat disc yang mengandung antimikroba dengan kadar tertentu. Selama inkubasi,
bahan antimikroba akan berdifusi ke dalam agar dan membentuk gradien konsentrasi. Dengan
mengukur zona hambatannya maka diketahui sifat kerentanan dari bakteri
(resisten/intermediat/sensitif)
Dasar Teori :
Obat-obatan telah digunakan untuk mengobati penyakit infeksi sejak abad ke-
17, namun kemoterapi sebagai ilmu pengetahuan dimulai oleh Paul Ehrlich pada awal abad
ke-20. Ehrlich merumuskan azas toksisitas selektif dan mengakui hubungan kimia spesifik
antara mikroba patogen dengan obat-obatan, resistensi obat oleh bakteri dan peranan terapi
kombinasi.
Antibiotik aadalah suatu substansi kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang
bersifat bakteriostatik atau bakterisid. Isolasi, pemfokusan, pemurnian dan produksi massal
dari penicillin kemudian diikuti juga oleh perkembangan streptomycin, tetracycline,
chloramphenicol dan agen antimikroba lainnya. Substansi-substansi tersebut didapat dari
memisahkan filtrat media yang ditumbuhi oleh jamur tertentu. Modifikasi sintetik kemudian
menjadi penting dan populer dalam perkembangan menciptakan bahan antimikroba baru.
Yang dimaksud pemeriksaan pengaruh antimikroba yaitu pengukuran kemampuan obat
antibiotika atau obat kimia tertentu dalam menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri
secara invitro. Adapun syarat antimikroba yang baik adalah :
1. Menghambat/membunuh bakteri patogen
2. Mempunyai kemampuan untuk mematikan atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme yang luas (broad spectrum)
3. Tidak bersifat alergik
4. Tidak menimbulkan efek samping bila dipakai lama
5. Tidak menyebabkan resistensi
6. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal
7. Tetap aktif dalam plasma dan seluruh cairan tubuh
8. Larut dalam air

Tujuan akhir dari pengujian AST adalah untuk memprediksikan sukses atau tidaknya
terapi antibiotik secara in-vivo. Pengujian dilakukan secara in-vitro, lalu diukur respons
pertumbuhan dari organisme isolat terhadap satu atau beberapa macam obat. Pengujian
dilakukan dalam kondisi terstandarisasi sehingga hasilnya dapat dipercaya. Hasil ini juga
digunakan sebagai panduan dalam memilih antibiotik yang tepat. Hasil dari pengujian AST
haruslah dikombinasikan dengan informasi klinis dan pengalaman sebelumnya dalam
menentukan antibiotik yang paling sesuai.
Pengukuran aktivitas suatu bahan antimikroba diperlukan untuk menentukan : (1)
Potensi bahan tersebut dalam larutan, (2) konsentrasinya dalam cairan tubuh atau jaringan,
dan (3) kerentanan mikroba yang diuji agar diketahui konsentrasi bahan antimikroba yang
efektif.
Ada beberapa faktor yang berpengaruh terhadap hasil pemeriksaan AST in-vitro, yaitu :
1. pH lingkungan ; sebagian obat aktif pada pH asam (nitrofurantoin), sebagian yang lain
pada suasana basa (aminoglikosida, sulfonamida).
2. Komponen media ; sodium polyanetholsulfonate (dalam kultur darah) dan deterjen
anionik lainnya dapat menghambat kerja aminoglikosida. PABA dalam ekstrak jaringan
antaganonis terhadap sulfonamida. Protein serum terikat/menempel pada penicillin
dengan derajat yang berbeda-beda, 40 – 98%.Penambahan NaCl pada media
meningkatkan resistensi methicillinolehS. aureus.
3. Stabilitas obat ; pada suhu inkubasi, beberapa obat justru kehilangan atau menurun
aktivitasnya. Penicillin akan terinaktifasi perlahan-lahan, sedangkan
aminoglikosidadanciprofloxacintetap stanil dalam waktu lama.
4. Ukuran inokulum ; secara umum, makin besar jumlah mikroba, makin rendah kerentanan
yang diperlihatkannya.Mikroba yang banyak akan sulit dihambat dibandingkan yang
sedikit.
5. Lamanya inkubasi ; dalam banyak kasus, mikroba tidak dibunuh tetapi hanya dihambat
karena paparan yang singkat oleh bahan antimikroba. Makin lama inkubasi, makin besar
kesempatan munculnya mutan yang resisten.
Awalnya, memilih bahan antimikroba didasarkan pada pengalaman klinik sebelumnya.
Seiring meningkatnya resistensi bakteri terhadap antimikroba karena cara-cara yang
dilakukan pada masa lalu, maka para ahli menjadi sulit dalam menentukan antimikroba yang
tepat. Oleh alasan itu, AST menjadi metode yang paling valid sekarang. Meskipun banyak
metode yang dilakukan dalam AST, tapi semuanya bertujuan mengetahui respon bakteri
terhadap terapi antimikroba.
Suatu metode dalam AST dipilih karena kepraktisannya, validasi data, mudah
disesuaikan (fleksibel), automasi, biaya, mudah dikembangkan, akurasi, dan pilihan
individu.Ada 3 metode yang sering dipakai dalam AST, yaitu :
1. Disc diffusion (Kirby-Bauer)
2. Broth dilution
3. Agar dilution
 Tes Kirby-Bauer merupakan uji kualitatif menggunakan kertas disc yang berisi satu
macam antibiotik dengan konsentrasi tertentu. Disc ditempatkan pada permukaan lempeng
agar yang telah ditanami bakteri. Selama masa inkubasi, antibiotik akan berdifusi keluar dari
disc dan membentuk gradien konsentrasi di sekitar disc. Setelah 16 – 24 jam, akan muncul
zona bening di sekitar disc antibiotik. Zona hambatan pertumbuhan diukur dan dibandingkan
dengan tabel standar berdasarkan jenis antibiotik dan bakteri yang diuji, kemudian hasilnya
dinyatakan dengan “Sensitif” (S), “Intermediat” (I), atau “Resisten” (R) terhadap antibiotik
yang digunakan.
Keuntungan dari metode ini adalah murah, disc bisa dimodifikasi dan dapat digunakan
sebagai tes saring untuk banyak isolat. Sedangkan kerugiannya antara lainperlu waktu untuk
pembacaan zona hambatan dan zona hambatannya dapat tumpang tindih.
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi ukuran diameter zona hambatan yaitu :
1. Kekeruhan suspensi bakteri ; bila kurang keruh diameter zona hambatan lebih lebar, bila
lebih keruh diameter zona hambatan makin sempit.
2. Waktu peresapan suspensi bakteri ke dalam media ; tidak boleh lebih dari batas waktu
yang diperbolehkan, karena dapat mempersempit diameter zona hambatan.
3. Temperatur inkubasi ; kurang dari 35oC menyebabkan diameter hambatan lebih lebar. Ini
bisa terjadi pada media plate yang ditumpuk-tumpuk lebih dari 2 plate pada inkubasinya.
Jika inkubasi pada suhu lebih dari 35oC, kadang-kadang ada bakteri yang kurang subur
pertumbuhannya, ada pula obat yang difusinya kurang baik.
4. Waktu inkubasi ; kurang dari 16 jam pertumbuhan bakteri belum sempurna sehingga sukar
dibaca atau diameter zona hambatan lebih lebar. Lebih dari 24 jam pertumbuhan lebih
sempurna sehingga diameter zona hambatan makin sempit.
5. Ketebalan agar ; ketebalan agar sekitar 4 mm. Kurang dari itu difusi obat lambat.
6. Jarak antar disc obat ; yang dianjurkan minimal 15 mm, untuk menghindari terjadinya
zona hambatan yang tumpang tindih. Petridish dengan diameter 9 – 10 cm dapat
digunakan untuk paling banyak 7 disc obat.
7. Disc obat ; tiap jenis obat harus mempunyai diameter disc yang sama, tetapi potensinya
boleh berbeda. Yang harus diperhatikan yaitu cara penyimpanan dan kadaluarsanya.
8. Komposisi media ; sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan bakteri, difusi obat,
aktivitas obat dan sebagainya.
Dalam penyiapan sampel untuk pemeriksaan AST, syarat utamanya adalah : (1) Bakteri
harus diisolasi ke dalam kultur murni, (2) harus dilakukan identifikasi terhadap sampel untuk
mengetahui subjek sampai ke tingkat genus atau spesies, dan (3) isolat harus disimpan untuk
pemeriksaan selanjutnya.
Alat :
 Cawan petri
 Pipet ukur
 Vallius ball
 Mortar
 Beaker glass
 Swab
 Disc obat
 Tabung reaksi
 Rak tabung
  Erlenmeyer
 Kapas steril
Bahan :
 Media NA atau Muller-Hinton
 Sampel bahan antimikroba
 Aquadest
 Suspensi bakteri
 NaCl steril

Prosedur Kerja :
Untuk antimikroba standar yang sudah diketahui
Prosedur :
1. Pembuatan media Mueller-Hinton
a. Ditimbang agar Mueller-Hinton dan dilarutkan dengan akuades di dalam erlenmeyer atau
gelas piala sambil dipanaskan
b. Sterilisasi dengan otoklaf
c. Setelah steril didinginkan 45 – 50C
d. Isikan media ke dalam plate dengan ketebalan agar sekitar 4 mm. Untuk mendapatkan
ketebalan 4 mm diisikan 60 – 70 ml media untuk plate berdiamater 150 mm atau 25 – 30
ml media untuk plate berdiameter 100 mm
e. Dinginkan pada suhu ruang dan disimpan pada suhu 2 – 8C
f. Media harus digunakan dalam 7 hari kecuali diberikan perlakukan khusus misalnya
dibungkus rapat di dalam plastik untuk mencegah pengeringan agar. Bila akan digunakan
keringkan dahulu di dalam inkubator 37oC selama 30 menit

2. Pembuatan standar kekeruhan

a. 0,5 ml 1,175% barium klorida dihidrat (BaCl2.2H2O) ke dalam gelas piala
b. Ditambah 99,5 mlasam sulfat 1%, kocok
c. Standard kekeruhan ini dimasukkan ke dalam tabung bertutup sebanyak 4 – 6 ml
d. Kekeruhan ini setara dengan kira-kira 1,5x108 sel/ml
e. Dapat disimpan di ruang gelap suhu kamar selama 6 bulan.Jika akan digunakan harus
dikocok dahulu

3. Pembuatan suspensi bakteri

a. Masukkan 1 ml NaCl ke dalam tabung reaksi
b. Masukkan koloni bakteri dengan ose
c. Campur, kocok lalu bandingkan dengan standar kekeruhan sampai kekeruhannya sama
d. Cara lain adalah dengan memasukkan 5 µl kultur kaldu yang dieramkan semalaman ke
dalam 5 ml kaldu atau air pepton

4. Penanaman padamedia Mueller-Hinton (MH) atau nutrient agar

a. Penanaman dilakukan paling lambat 15 menit setelah suspensi dibuat
b. Dengan swab steril diambil suspensi bakteri, swab ini harus diputar-putar beberapa kali
dan ditekan pada dinding bagian dalam tabung suspensi
 c. Inokulasikan ke permukaan media secara merata sehingga semua permukaan media
tertutupi
d. Biarkan plate dalam keadaan terbuka sedikit selama 3 – 5 menit untuk mengurangi
kelembaban di dalamnya
e. Lakukan penempelan disc antibiotik :
1) Pinset disterilkan pada lampu spiritus
2) Ambil disc antibiotik
3) Tempelkan pada permukaan media, jarak disc terhadap pinggir plate ± 2 cm dan
jarak antar disc ± 3 cm. Plate berdiamater 150 mm tidak boleh diisi lebih dari 12
disc dan plate berdiamater 100 tidak boleh lebih dari 5 disc
4) Jangan menekan disc ke dalam agar dan jangan memindahkan disc yang sudah
menempel
f. Inkubasi pada 35oC selama 16 – 24 jam dengan posisi agar di bawah (jangan dibalik)
g. Ukur diameter zona hambatan pertumbuhan dan cocokkan dengan tabel, dengan aturan
sebagai berikut :
1) Pembacaan/pengukuran diameter zona hambatan dengan beralaskan kertas berwarna
gelap atau dengan latar belakang sedikit gelap, diukur diameter zona hambatan. Cara
lain yang lebih tepat yaitu menggunakan zone reader
2) Kalau media ditambah darah, hemoglobin, atau serum (media tidak tembus cahaya),
pengukuran diameter zona hambatan dilakukan dengan membuka tutup plate, diukur
pada permukaan agar-agar
3) Diameter zona hambatan yang diukur yaitu daerah jernih sekitar disc obat (tidak ada
pertumbuhan bakteri), diukur dari ujung yang satu ke ujung yang lain melalui
tengah-tengah disc obat, dengan beberapa catatan sebagai berikut :
a) Sulfonamide dan cotrimoxazole, pertumbuhan tipis di atas zona hambatan tidak
perlu diperhatikan
b) Pertumbuhan Proteus yang menjalar di daerah zona hambatan juga tidak perlu
diperhatikan
c) Pada Staphylococcus yang memproduksi beta lactamase terhadap penicillin akan
timbul zona hambatan bertingkat, berapapun ukuran diameter zona hambatan itu,
harus selalu dilaporkan resisten. Seperti halnya Serratia marcescens terhadap
colistin/polimixin B.

Untuk bahan antimikroba yang belum diketahui daya hambatnya

Cara ini digunakan terhadap bahan antimikroba yang belum diketahui kemampuannya dalam
menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Caranya ialah membandingkan kekuatan bahan
antimikroba tersebut dengan antibiotik standar yang telah diketahui kemampuannya dalam
menghambat pertumbuhan bakteri yang diuji
Prosedur :
1. Buatlah seri pengenceran bahan antimikroba
2. Bahan ini diresapkan ke dalam disc kosong yang terbuat dari kertas saring Whatman No. 1
berdiameter 6 mm
3. Cara seterusnya dan aturan-aturan yang berlaku sama dengan pengujian yang
menggunakan antibiotik komersial
4. Hasil pengujian disimpulkan dengan bagaimana kekuatan bahan antimikroba yang diuji
dalam membunuh bakteri dibandingkan dengan antibiotik komersial dalam menghambat
pertumbuhan bakteri yang tertentu
Hasil :

Diameter zona hambatan (mm)

Kemoterapia/Antibiotika Potensi obat
Resisten Intermediat Sensitif
 Amikacin 30 mcg 14/kurang 15 - 16 17/lebih
Ampicillin
- Gram negatif& enterococci 10 mcg 11/kurang 12 - 13 14/lebih
- Haemophilus 10 mcg 19/kurang -------- 20/lebih
- Staphylococcus 10 mcg 20/kurang 21 - 28 29/lebih
Amoxicillin/clavulanic acid 20/10 mcg 13/kurang 14 - 17 18/lebih
- Haemophilus & 20/10 mcg 19/kurang -------- 20/lebih
Staphylococcus
Carbenicillin 100 mcg 17/kurang 18 - 22 23/lebih
- Enterobacteriaceae 100 mcg 13/kurang 14 - 16 17/lebih
- Pseudomonas aeruginosa 10 unit 8/kurang 9 - 12 13/lebih
Bacitracin 30 mcg 14/kurang 15 - 22 23/lebih
Cefotaxime 30 mcg 14/kurang 15 - 17 18/lebih
Cephalothin 30 mcg 14/kurang 15 - 17 18/lebih
Cephazidime 30 mcg 13/kurang 14 - 20 21/lebih
Ceftriazona 30 mcg 14/kurang 15 - 17 18/lebih
Cefuroxime 30 mcg 12/kurang 13 - 17 18/lebih
Chloramphenicol 10 mcg 8/kurang 9 - 10 11/lebih
Colistin 25 mcg 10/kurang 11 - 15 16/lebih
Cotrimoxazole 30 mcg 12/kurang 13 - 15 16/lebih
Doxycycline 15 mcg 13/kurang 14 - 17 18/lebih
Erytromycin 10 mcg 12/kurang 13 - 14 15/lebih
Gentamycin 10 mcg 13/kurang 14 – 15 16/lebih
Imipenem 30 mcg 13/kurang 14- 17 18/lebih
Kanamycin 5 mcg 9/kurang 10 - 13 14/lebih
Methicillin 30 mcg 14/kurang 15 - 18 19/lebih
Minocycline 30 mcg 14/kurang 15-22 23/lebih
Moxalactam 30 mcg 13/kurang 14 – 18 19/lebih
Nalidixic acid 30 mcg 12/kurang 13 - 16 17/lebih
Neomycin 300 mcg 14/kurang 15- 16 17/lebih
Nitrofurantoin 10 mcg 12/kurang 13 - 16 17/lebih
Norfloxacin 1 mcg 10/kurang 11-12 13/lebih
Oxacillin 10 unit 20/kurang 21 - 28 29/lebih
Penicillin G untuk 10 mcg 11/kurang 12-21 22/lebih
Staphylococcus 100 mcg 14/kurang 15 - 17 18/lebih
- Bakteri lainnya 10 mcg 11/kurang 12 - 14 15/lebih
Piperacillin 300 mcg 12/kurang 13 - 16 17/lebih
Streptomycin 30 mcg 14/kurang 15 - 18 19/lebih
Sulfonamide 75 mcg 11/kurang 12 - 14 15/lebih
Tetracycline 10 mcg 12/kurang 13 - 14 15/lebih
Ticarcillin 30 mcg 9/kurang 10 - 11 12/lebih
Tobramycin
Vancomycin

Pembahasan :
Bahan antimikroba berfungsi untuk mematikan, merusak, dan menghambat
pertumbuhan dari mikroba. Antimikroba bekerja dengan cara merusak dinding sela tau
merusak protein dari mikroba sehingga mikroba tersebut mati. Bahan antimikroba bekerja
dengan beberapa mekanisme yaitu membunuh dirinya sendiri, mempertahankan hidupnya,
dan melawan bakteri lain.
Digunakan metode difusi agar untuk mengetahui aktivitas antimikroba. Mikroba uji
dinokulasikan pada media pertumbuhan (Nutrient Agar atau Mueller-Hinton) dan diletakkan
disc antimikroba di atasnya.
Tes Kirby-Bauer merupakan uji kualitatif menggunakan kertas disc yang berisi satu
macam antibiotik dengan konsentrasi tertentu. Disc ditempatkan pada permukaan lempeng
agar yang telah ditanami bakteri. Selama masa inkubasi, antibiotik akan berdifusi keluar dari
disc dan membentuk gradien konsentrasi di sekitar disc. Setelah 16 – 24 jam, akan muncul
zona bening di sekitar disc antibiotik. Zona hambatan pertumbuhan diukur dan dibandingkan
dengan tabel standar berdasarkan jenis antibiotik dan bakteri yang diuji, kemudian hasilnya
dinyatakan dengan “Sensitif” (S), “Intermediat” (I), atau “Resisten” (R) terhadap antibiotik
yang digunakan.
Jika pada sekitar disc terdapat zona bening, hal ini menunjukkan bahwa bahan
antimikroba tersebut efektif dalam membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri.

Daftar Pustaka :
- https://www.academia.edu/19777940/Laporan_praktikum_metode_Kirbiy_Bauer_dan
_MIC?auto=download
- https://bismillahdodbest.wordpress.com/2012/03/26/uji-resistensi-bakteri-terhadap-
antibiotika-menggunakan-metode-difusi/
- http://disachem.blogspot.com/2012/04/laporan-praktikum-mikrobiologi-uji_28.html
- Modul praktikum bakteriologi