Metode-Metode Uji Bakteri

secara in vitro
1. Metode diffusa : (Kirby Bauer)
- Metode agar disk-diffusion
- Metode gradien antimikroba
- Metode agar well diffusion
- Metode agar plug diffusion
- Metode Cross streak
- Metode poisoned food
2. Thin-layer chromatography (TLC)-bioautography
- Agar diffusion
- Direct bioautography
- Agar overlay bioassay
3. Metode dilusi (pengenceran)
- Metode Broth dilution
- Metode agar dilution
4. Time-kill test (time-kill curve)
5. ATP bioluminescene assay
6. Flow cytofluorometric method
 Metode agar disk-diffusion
– Metode yang rutin digunakan di lab. klinik untuk
uji sensitivitas/resistensi bakteri terhadap
berbagai antimikroba
– Telah di-standarisasi untuk menguji bakteri
Streptococci, Haemophilus influenzae,
Haemophilus parainfluenzae, Neisseria
gonorrhoeae dan Neisseria meningitidis
Prosedur umum:
1.Menggunakan agar plates Mueller Hinton yang diinokulasi dengan
100 mcl suspensi inokulum mikroorganisme (dalam larutan NaCl
0,9% dengan tingkat kekeruhan standar McFarland 0,5), dioleskan
secara merata setebal 4-6 mm dengan hockey stick atau kapas lidi
ukuran besar.
2.Cawan petri ditutup dan diamkan selama 5 menit.
3.Setelah itu buka tutup cawan petri, tempelkan disk (cakram)
diameter 6 mm yang mengandung senyawa uji di atas permukaan
agar, dengan jarak antar disk 2 cm
4.Inkubasi cawan pada suhu 36-38 0C selama 18-24 jam
5.Ukur diameter zona hambat yang terbentuk dalam satuan milimeter
– Kelebihan: sederhana, murah, dapat digunakan
untuk menguji banyak mikroorganisme dan agen
antimikroba, interpretasi hasil mudah
 Metode Gradien Antimikroba
• Menggabungkan prinsip metode dilution
dengan metode difusi untuk menentukan nilai
minimum inhibitory concentration (MIC).
• Digunakkan untuk menentukan MIC antibiotic,
antifungi dan antimikobakteria
• Etests (BioMerieux)  versi komersial
Prosedur
1. Strip yang mengandung agen antimikroba dengan gradien
konsentrasi meningkat dari ujung ke ujung diletakkan pada
permukaan agar yang telah diinokulasi dengan
mikroorganisme uji
2. Nilai MIC ditentukan pada irisan strip dan elips inhibisi
pertumbuhan.
 Metode Agar Well Diffusion

– Digunakan untuk mengevaluasi aktivitas

antimikroba dari ekstrak tanaman atau mikroba.
Prosedur:
1. Permukaan agar yang telah diinokulasi dengan
mikroba dibuat lubang berdiameter 6-8 mm dengan
pelubang steril.
2. 20-100 mL agen antimikroba dimasukkan kedalam
sumur
3. Agar plate lalu diinkubasi
 Metode agar plug diffusion
Digunakan untuk mengamati antagonisme antara
mikroorganisme
Prosedur:
1. Galur mikroba yang diuji ditumbuhkan pada medium kultur yang
sesuai
2. Selama pertumbuhan, sel-sel mikroba mensekresikan molekul-
molekul yang berdifusi ke medium agar
3. Setelah diinkubasi, agar dipotong berbentuk silinder (plug) dan
diletakkan di atas permukaan agar lain yang telah diinokulasi
mikroorganisme kedua
4. Aktivitas antimikroba dideteksi melalui adanya zona inhibisi di
sekitar plug agar
 Metode Cross streak

– Digunakan untuk penapisan cepat mikroorganisme

untuk antagonisme.
Prosedur:
1. Galur mikroba yang ingin diuji ditanam dengan single streak
di bagian tengah agar plate
2. Setelah diinkubasi, mikroba lainnya ditanam dengan single
streak tegak lurus terhadap streak sebelumnya
3. Inkubasi, kemudian analisis ukuran zona inhibisi
 Metode poisoned food
Digunakan untuk mengevaluasi efek antifungi
Prosedur:
1. Agen atau ekstrak antifungi digabungkan kedalam agar cair hingga
konsentrasi akhir yang diinginkan.
2. Medium kemudian dituangkan ke cawan petri
3. Setelah diinkubasi semalaman, dilakukan inokulasi dengan menggunakan
mycelia disc (2-5 mm) diletakkan di tengah plate
4. Setelah diinkubasi, diameter pertumbuhan fungi dan sample plates diukur

– Efek antifungi diperkirakan dengan formula: Aktivitas antifungi (%) = (Dc –

Ds/Dc) x 100
Dc: diameter pertumbuhan pada plate kontrol
Ds: diameter pertumbuhan pada plate dengan agen antifungi
Thin-layer chromatography (TLC)-
bioautography
 Agar diffusion
• Melibatkan transfer melalui difusi agen antimikroba
dari kromatogram ke agar plate yang telah
diinokulasi dengan mikroorganisme yang diuji
• Setelah beberapa menit/jam kromatogram diambil
dan agar plate diinkubasi. Zona inhibisi kemudian
dievaluasi
 Direct bioautography
Paling sering digunakan dibandingkan kedua metode lain
Prosedur:
1. TLC plate dibenamkan atau disemprot dengan suspensi
mikroba
2. Bioautogram kemudian disemprot dengan p-
Iodonitetrazolium violet dan diinkubasi pada 25 0C selama 48
jam pada kondisi lembap

– P-Iodonitetrazolium violet merupakan garam tetrazolium yang

digunakan sebagai reagen untuk deteksi. Garam tersebut
mengonversi formazan menjadi berwarna akibat
dehidrogenase sel-sel hidup. Hal ini dapat memvisualisasi
pertumbuhan mikroba
 Agar overlay bioassay
Disebut juga immersion bioautography, merupakan
hybrid kedua metode sebelumnya.
Prosedur:
1. TLC plate dilapisi dengan medium agar cair berisi
bakteri kemudian diinkubasi
2. Setelah inkubasi, pewarnaan dilakukan dengan
tetrazolium
 Metode Dilusi
• metode paling tepat untuk menentukan nilai
MIC. MIC adalah konsentrasi terendah agen
antimikroba yang menghambat pertumbuhan
mikroorganisme yang diuji, dinyatakan dalam
mg/mL atau mg/L
 Broth dilution method
Prosedur:
1. Agen antimikroba diencerkan dua kali (misalnya 1, 2, 4, 8, 16 dan
32 mg/mL) pada medium pertumbuhan cair dalam tabung 2 mL
(microdilution) atau dalam 96-well microtitration plate
(microdilution)
2. Inokulum mikroba kemudian diinokulasikan ke dalam setiap
tabung atau sumur lalu diinkubasi
Beberapa metode dapat memakai reagen pewarna sebagai indicator
pertumbuhan mikroorganisme seperti:
• Tetrazolium salts
• MTT
• XTT
 Agar dilution method
– Melibatkan penggabungan berbagai konsentrasi
agen antimikroba ke dalam agar cair, biasanya
menggunakan pengenceran dua kali yang berseri,
diikuti inokulasi bakteri uji ke permukaan agar plate
– Bila isolat yang diuji banyak atau bila warna
senyawa/ekstrak menyamarkan deteksi
pertumbuhan mikroba di medium cair, maka
metode agar dilution lebih baik dibandingkan broth
dilution
 Time-kill test (time-kill curve)

• Menentukan efek antimikroba berdasarkan waktu atau konsentrasi.

Prosedur:
1. Uji dilakukan dalam medium kultur cair menggunakan 3 tabung yang
mengandung 5x105 CFU/mL suspense bakteri.
2. Tabung pertama dan kedua mengandung molekul atau ekstrak yang diuji dengan
konsentrasi akhir 0,25 kali MIC dan 1 kali MIC. Tabung kedua berperan sebagai
kontrol pertumbuhan.
3. Inkubasi dilakukan dengan variasi internal waktu (0, 4, 6, 8, 10, 12 dan 24 jam)
4. Presentase sel-sel yang mati lalu dihitung relatif terhadap kontrol pertumbuhan
dengan menentukan jumlah sel yang hidup (CFU/mL) dari setiap tabung

• Metode ini dapat digunakan untuk menentukan sinergisme atau antagonisme

antar obat dalam kombinasi
 ATP bioluminescence assay
• Didasarkan pada pengukuran ATP yang diproduksi
bakteri atau fungi, untuk estimasi populasi
mikroba
• Keberadaan ATP akan mengonversi luciferin 
oxyluciferin yang memancarkan cahaya. Kuantifikasi
emisi cahaya kemudian diukur dengan luminometer
dalam relative light unit (RLU) yang dikonversikan
menjadi RLU/mol ATP.
• Keuntungan: cepat dan dapat digunakan untuk uji
antimikroba secara in vivo atau in situ
 Flow cytofluorometric method
• Metode untuk meneliti aktivitas antijamur dan
antibakteri
• Pewarnaan DNA: propidium iodida, zat
fluorescent dan intercalating agent
• Hasil direproduksi dengan cepat (2-6 jam) dari
metode mikrodilusi