LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
PERCOBAAN 4
PENENTUAN KADAR ANTIBIOTIK TETRASIKLIN
Dosen pengampu : Maulita Cut Nuria, M.Sc.,Apt.

Dususun oleh :

1. Rahmawati Sumaya 19105011046

2. Tarisha Ama Melia Hana 19105011048
3. Selina Nur Asrianto 19105011049
4. Fitri Lestari Andriani 19105011050
5. Try Octaviona Pratami 19105011052

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS WAHID HASYIM
SEMARANG
2020
 A. TUJUAN PRAKTIKUM
Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa diharapkan dapat :
1. Melakukan penetapan kadar antibiotik dan mempersiapkan peralatan untuk kerja
mikrobiologi
2. Menghitung konsentrasi dari sampel yang ditentukan

B. DASAR TEORI
Antibiotik sebagai sebuah senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme, pada
konsentrasi rendah dapat memusnahkan atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme
lain. Pengujian potensi antibiotik dilakukan untuk memberikan jaminan bahwa kualitas dan
mutu antibiotik yang digunakan dalam pengobatan memenuhi persyaratan yang telah
ditentukan (Radji and Manurung, 2010).
Pentingnya penentuan kadar antibiotik karena terjadinya efek penggunaan antimikroba yang
meningkat, sehingga meningkat pula efek resistensi berbagai mikroba patogen serta
efektivitas daya hambat atau daya bunuh antimikroba sangat tergantung pada jumlah dan
kekuatan zat aktifnya.Pada umumnya, terdapat beberapa metode penentuan kadar antibiotik
diantaranya :
a. Metode Turbidimetri
Prinsip metode turbidimetri adalah berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan
mikroorganisme dalam media cair yang mengandung larutan antibiotik. Kurva
pertumbuhan bakteri uji dihitung dengan menggunakan metode turbidimetri dengan
memakai alat spektrofotometer UV-vis. Metode turbidimetri memiliki kelebihan,
yaitu cepat, tidak deskriptif dan tidak mahal (Iswadi, 2016).
Metode turbidimetri merupakan cara yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri
dalam suatu larutan dengan menggunakan alat spektofotometer. Digunakan untuk uji
antibakteri, dimana jumlah bakterinya dihitung dengan membandingkan kekeruhan
suspensi bakteri dengan menggunakan larutan standar McFarland (Fitri, 2015).
b. Metode Lempeng Silinder
Prinsip metode lempeng silinder atau difusi agar adalah membandingkan zona
hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji oleh dosis senyawa antibiotik yang diuji
terhadap zona hambatan oleh dosis antibiotik baku pembanding pada media lempeng
agar (Jawetz et al., 2001)
c. Metode Difusi
Metode difusi digunakan dalam uji sensitivitas bakteri. Metode tersebut dilakukan
dengan cara mengamati daya hambat pertumbuhan mikroorganisme oleh ekstrak yang
diketahui dari daerah di sekitar kertas cakram (paper disc) yang tidak ditumbuhi oleh
 mikroorganisme. Zona hambatan pertumbuhan inilah yang menunjukkan sensitivitas
bakteri terhadap bahan anti bakteri.
d. Metode Pengenceran
Sejumlah obat antimikroba tertentu dicampurkan pada perbenihan bakteri yang cair
atau padat. Kemudian perbenihan tersebut ditanami dengan bakteri yang diperiksa,
dan dieram. Titer obat ialah jumlah obat antimikroba yang dibutuhkan untuk
menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri yang diperiksa. Tes kepekaan
pengenceran-agar memakan waktu, dan penggunaannya terbatas pada keadaan
khusus. Tes pengenceran-kaldu tidak praktis dan jarang digunakan bila pengenceran
harus dibuat dalam tabung reaksi; namun, adanya serentetan pengenceran-kaldu yang
sudah disiapkan untuk pelbagai obat dalam lempeng mikrotiter telah meningkatkan
dan mempermudah cara tersebut. Keuntungan tes pengenceran kaldu mikrodilusi ialah
memungkinkan adanya hasil kuantitatif, yang menunjukkan jumlah obat yang
diperlukan untuk menghambat (mematikan) mikroorganisme yang diperiksa.
e. Metode Difusi
Cakram kertas saring, cawan yang berliang renik, atau silinder tidak beralas, yang
mengandung obat dalam jumlah tertentu ditempatkan pada perbenihan padat yang
telah ditanami dengan biakan tebal organisme yang diperiksa. Setelah pengeraman,
garis tengah daerah hambat jernih yang mengelilingi obat dianggap sebagai ukuran
kekuatan hambatan obat terhadap organisme yang diperiksa. Metode ini dipengaruhi
banyak faktor fisik dan kimiawi di samping interaksi antara obat dan organisme
(misalnya, sifat perbenihan dan daya difusi, ukuran molekul, dan stabilitas obat).
Meskipun demikian, dengan standarisasi keadaan akan memungkinkan pengukuran
kuantitatif potensi obat atau kepekaan organisme.Bila menentukan kepekaan bakteri
dengan cara difusi, sebagian besar laboratorium menggunakan cakram kertas saring
yang telah diberi antibiotika. Suatu gradien konsentrasi antibiotika terbentuk dalam
perbenihan melalui difusi cakram. Karena difusi merupakan suatu proses yang terus
berjalan, gradien konsentrasi ini tidak pernah stabil untuk waktu lama; tetapi suatu
stabilisasi tertentu dapat diciptakan dengan membiarkan difusi berlangsung sebelum
bakteri tumbuh pada perbenihan. Kesulitan terbesar ialah laju pertumbuhan yang
beragam di antara pelbagai mikroorganisme.Interpretasi hasil tes difusi harus
didasarkan pada perbandingan antara metode pengenceran dengan metode difusi.
Perbandingan ini telah dibuat, dan juga rujukan standar internasional telah dibuat.
Garis regresi linear dapat menyatakan hubungan antara log konsentrasi minimum
hambatan pada tes pengenceran dan garis tengah daerah hambatan pada tes
difusi.Penggunaan cakram tunggal untuk tiap antibiotika dengan keadaan tes yang
 standar memungkinkan penilaian kepekaan atau resistensi mikroorganisme dengan
membandingkan ukuran daerah hambatan terhadap suatu patokan obat yang sama
(metode Kirby-Bauer). Penghambatan di sekeliling lempengan yang mengandung
sejumlah obat antimikroba tidak menimbulkan kepekaan terhadap kadar obat yang
sama permilimeter, darah, atau urine.
Faktor-faktor yang mempengaruhi penentuan kadar antibiotik yaitu antara lain :
1. Difusi antimikroba pada sel dan jaringan
2. Protein serum pengikat antimikroba
3. Gangguan dan interaksi obat
4. Status daya tahan dan sistem imun pasien
5. Mengidap beberapa penyakit secara bersamaan
6. Virulensi dan patogenitas bakteri yang menginfeksi
7. Tempat infeksi dan keparahan penyakit

C. ALAT DAN BAHAN

Alat :
1. Piring petri
2. Paperdisk (Blankdisk)
3. Pinset
4. Mikropipet dan yellow tip
5. Jangka sorong
6. Gelas ukur 10 ml
Bahan :

1. Larutan stok tetrasiklin konsentrasi 300, 600, 900 dan 1200 µm/mL
2. Larutan stok tetrasiklin konsentrasi 400, 800, 1200 dan 1600 µm/mL
3. Bakteri Escherichia coli (E.coli)
4. Bakteri Staphylococcus aureus (S.aureus)

D. CARA KERJA
1. Kadar antibiotic tetrasiklin terhadap bakteri escherichia coli
Media yang digunakan untuk penetuan kadar antibiotic tetrasiklin adalah antibiotic no 1 yang
berisi suspensi E.coli

Disiapkan larutan konsentrasi tetrasiklin sebasar 4000 g/ml untuk penentuan kadar
Dilakukan pengenceran sehingga mendapatkan konsentrasi larutan tetrasiklin 300 g/ml, 600
g/ml, 900 g/ml. 1200 g/ml

Disiapkan larutan stok tetrasiklin 4000 g/ml sehingga diperoleh beberapa konsentrasi
400 g/ml, 800 g/ml, 1200 g/ml, 1600 g/ml

Kemudian dibagi menjadi beberapa sector, untuk jumlah sector menyesuaikan dengan serial
konsentrasi, ada 4 serial konsentrasi ditambah 1 sempel yang belum diketahui kadarnya
maka jumlah sampelnya ada 5

Dibagi menjadi 5 sektor kemudian ditandai dengan garis pemisah dan diberi penomeran

Ditempelkan blank disk/paper disk pada permukaan media, sebelumnya tutup petri
dipanaskan terlebih dahulu menggunakan uap panasnya saja

Mulut petri dipanaskan sisinya kemudian blank disk diambil menggunakan pinset yang
dipanaskan ujungnya sebentar

Didorongkan kesalah satu sisi blank disk paling atas apabila sudah keluar disisinya kemudian
diambil dengan pinset dan ditempelkkan kepermukaan media

Dibuka sedikit tutup petrinya, kemudian blank disk dilepaskan dan ditekan pelan-pelan,
kemudian tutup pentri dan diambil blank disk lagi untuk beberapa sector lainnya

Masing-masing sector ditetesi menggunakan mikropipet 10 µl dengan yellowtip untuk

mengambil cairan

Diambil sampel A untuk sektor A

Diambil konsentrasi dari terkecil hingga konsentrasi besar

 Sampel B diambil untuk sektor B dan untuk konsentrasi yang digunakan yaitu : 3,6,9,12
g/ml

Media yang telah ditetesi larutan tetrasiklin ditunggu 15-20 menit agar larutan tetrasiklin
meresap maksimal di blank disk

Dimasukkan kedalam incubator dalam posisi petri terbalik dengan suhu 37◦C selama 24 jam

Diukur pers regresi linier dari serial konsentrasi 4,8,12,16 g/ml menggunakan jangka sorong

Dibuat kurva baku y = bx + A dari larutan standar, y = diameter zona hambat (mm), X = log
kadar (mg/ml) dan ditentukan kadar tetrasiklin sampel menggunakan kurva baku tersebut.

2. Kadar antibiotic tetrasiklin terhadap bakteri staphylococcus

Cairkan media antibiotik no. 1 disterilkan, ditunggu sampai suhu 40°C, lalu
dicampurkan suspensi bakteri uji.
↓
dituangkan ke dalam piring petri steril masing – masing 10 ml, ditunggu hingga
beku.
↓
piring petri dibagi menjadi 6 sektor

paperdisk dipasang di atas permukaan media yang telah beku 20

diteteskan sebanyak 10 µl sampel yang diuji (sektor 1) dan larutan standar

(sektor 2 – 6) pada paperdisk.
↓
Inkubasi 24 jam pada suhu 37°C
↓
diukur diameter zona hambat
↓
dibuat kurva baku Y = BX + A dari larutan standar, Y = diameter zona hambat
3. (mm), X = log kadar (mg/ml)
 ↓
kadar tetrasiklin sampel ditentukan menggunakan kurva baku tersebut.
E. HASIL PANGMATAN
a. Hasil kadar antibiotic tetrasiklin terhadap bakteri escherichia coli

Sampel A

Seri konsentrasi = 4, 8, 12, 16 µg/disk

Konsentrasi Log konsentrasi Diameter Daerah Hambat
(µg/disk) (mm)
A 20,0
4 0,602 18,9
8 0,903 20,9
12 1,079 21,4
16 1,204 22,5

Persamaan regresi linier

y = bx + a
b = 5,708 y = 20,0 mm (DDH sampe A)
a = 15,518 x = konsentrasi sampel A
y = 5,708 x + 15,518
x = 20,0 – 15,518
5,708
x = 0,785 antilog = 6,10 µg/disk

Sampel B
Seri konsentrasi = 3, 6, 9, 12 µg/disk
Konsentrasi (µg/disk) Log konsentrasi DDH (mm)
B 19,36
3 0,477 15,78
6 0,778 18,1
9 0,954 19,4
12 1,079 20,54
Persamaan regresi linier
y = bx + a
b = 7,821 y = 19,36 mm (DDH sampe B)
a = 12,025 x = konsentrasi sampel B
y = 7,821 x + 12,025
x = 19,36 – 12,025
7,821
x = 0,937 antilog = 8,65 µg/disk

b. Hasil kadar antibiotic tetrasiklin terhadap bakteri staphylococcus

Sampel A
Seri konsentrasi = 4, 8, 12, 16 µg/disk

Konsentrasi Log konsentrasi Diameter Daerah Hambat

(µg/disk) (mm)
A 18,7
4 0,602 16,68
8 0,903 19,5
12 1,079 20,8
16 1,204 21,78

Persamaan regresi linier

y = bx + a
a = 11,674
b = 8,463
y = 8,463x + 11,674
x = 18,7 – 11,674
8,463
x = 0,8302 antilog = 6,76 µg/disk
Sampel B
Seri konsentrasi = 3, 6, 9, 12 µg/disk
Konsentrasi (µg/disk) Log konsentrasi DDH (mm)
B 18,88
3 0,477 17,1
6 0,778 17,4
9 0,954 18,76
12 1,079 19,26

Persamaan regresi linier

y = bx + a
b = 3,723
a = 15,069
y = 3,723x + 15,069
18,88 = 3,723x + 15,069
3,723x = 18,88 – 15,069
x = 18,88 – 15,069
3,723
x = 1,024 antilog = 10,568

F. HASIL DAN PEMBAHASAN

Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis
yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh
mikroorganisme lainnya. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang
beragam. Mekanisme kerja antibiotik antara lain adalah menghambat sintesis dinding
sel, merusak permeabilitas membran sel, menghambat sintesis RNA (proses
transkripsi), menghambat sintesis protein (proses translasi), menghambat replikasi
DNA. Tetracycline merupakan antibiotik bakteriostatis yang berikatan dengan subunit
ribosomal 16S-30S dan mencegah pengikatan aminoasil-tRNA dari situs A pada
ribosom, sehingga dengan demikian akan menghambat translasi protein. Antibiotik
tetracycline bersifat bakteriostatik pada bakteri gram positif maupun gram negatif.
Mekanisme kerjanya mengganggu sintesis protein kuman spektrum kerjanya luas
kecuali terhadap Psudomonas & Proteus. Tetracycline berasal dari jamur
Streptomyces aurefaciens dan Streptomyces viridifaciens.
 Tembaga adalah salah satu jenis logam berat, tembaga digunakan karena
diketahui bahwa logam berat merupakan salah satu zat yang dapat menghambat
pertumbuhan mikroba.
Prinsip dari percobaan ini adalah penghambatan terhadap pertumbuhan
mikroorganisme, yaitu zona hambatan akan terlihat sebagai daerah jernih di sekitar
daerah yang mengandung zat antibakteri. Diameter zona hambatan pertumbuhan
bakteri menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap zat antibakteri. Selanjutnya
dikatakan bahwa semakin lebar diameter zona hambatan yang terbentuk bakteri
tersebut semakin sensitif.
Pada percobaan ini medium yang digunakan adalah medium NA (Nutrien Agar),
karena medium ini dispesifikasikan untuk pembiakan bakteri dan sampel fungi yang
digunakan adalah khamir jenis Candida albicans.
Berdasarkan hasil pengamatan setelah sampel diinkubasi selama 48 jam,
diperoleh hasil bahwa pada cawan petri yang diberikan antibiotik tetracycline,
terdapat zona hambat yang ditandai dengan daerah sekitar antibiotik berwarna bening.
Terdapatnya zona hambat pada percobaan tersebut disebabkan karena khamir tersebut
tidak resisten terhadap antibiotik yang ditanam pada media yang sama. Resistensi ini
merupakan suatu sifat tidak terganggunya kehidupan sel mikroba oleh antimikroba.
Sifat ini merupakan suatu mekanisme alamiah untuk bertahan hidup. Resistensi dari
khamir tersebut biasanya disebabkan karena khamir tersebut dapat menghasilkan
suatu enzim yang dapat menghancurkan antibiotik tersebut.
Sedangkan pada cawan petri yang diberikan uang logam tidak ditemukan
adanya zona hambat pada daerah sekitar logam. Tidak terjadinya zona hambat pada
daerah sekitar logam disebabkan karena khamir tersebut memiliki resistensi terhadap
logam yang ditanam pada media yang sama. Jadi khamir tersebut dapat tumbuh
walaupun terdapat logam di sekitarnya karena memiliki sifat resistensi yaitu
kemampuan untuk bertahan hidup. Selain itu hal lain yang dapat menyebabkan tidak
adanya zona hambat, yaitu faktor dari logam itu sendiri. Logam yang digunakan
adalah uang logam kuning yang tidak sepenuhnya tersusun atas unsur kimia tembaga
(Cu), tetapi masih banyak terdapat unsur-unsur lain yang menjadi penyusun logam
tersebut.
Sebab lain yang menyebabkan tidak adanya zona hambat pada media tersebut
dikarenakan oleh kesalahan dalam proses pengujian sensitivitasnya. Pada saat
memasukkan logam, keadaan logam masih sangat panas dan medium juga masih
belum terlalu memadat sehingga mengakibatkan medium mengalami kerusakan.
 G. Kesimpulan.
1. Antibiotik merupakan substansi kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme (bakteri,
fungi, atau aktinomiset) yang mampu menghambat pertumbuhan atau
membunuh mikroba lain.Antibiotik harus bersifat toksik untuk mikroba, tetapi relatif
tidak toksik untuk hospes.
2. Dari hasil uji resitensi mikroba diketahui bahwa bakteri resisten terhadap antibiotik
tetracyclin. Tetracycline bekerja dengan menghambat pertumbuhan dan perkembangan
bakteri. Kemudian dalam kadar antibiotik tetracycline perlu dibuat larutan stok terlebih
dahulu.
3. Resistensi antibiotika ialah kemampuan dari bakteri atau mikroorganisme lain untuk
menahan efek antibiotika.
4. Terbentuknya zona hambat pada cawan yang ada antibiotiknya karena antibiotic
menghambat sintesis dinding sel, menghambat sintesis protein, merusak membran
plasma, menghambat sintesis asam nukleat, dan menghambat metabolisme esensial.

A. Lampiran

Video A

Media E.coli

Video B
Media Staphylococcus aureus (S.aureus)
 PERTANYAAN

1. Dalam metode difusi agar, sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang

mempengaruhi hasil pengukuran kadar antibiotika!
Jawab:
a. Pradifusi, perbedaan waktu pradifusi mempengaruhi jarak dufusi dari zat uji
yaitu difusi antar pencandang.
b. Ketebalan medium agar adalah penting untuk memperoleh sensivitas yang
optimal. Perbedaan ketebalan media mempengaruhi difusi dari zat uji ke
dalam agar, sehingga akan mempengaruhu diameter hambat. Makin tebal
media yang digunakan akan makin kecil diameter hambatan yang terjadi.
c. Kerapatan inokul, ukuran inokulum merupakan faktor terpenting yang
mempengaruhi lebar daerah hambat, jumlah inokulum yang lebih sedikit
menyebabkan obat dapat lebih jauh menyebar, sehingga daerah yang
dihasilkan lebih besar, sedangkan jika jumlah inokulum lebih besar maka
akan dihasilkan daerah hambat yang kecil.
d. Komposisi media kgar, perubahan komlosisi media dapat merubah sifat
media sehingga jarak difusu berubah. Media agar berpengarug terhadap
ukuran daerah hambat dalam hal mempengaruhi aktivitas beberapa bakteri,
mempengaruhi kecepatan difusi antibakteri dan mempengaruhi kecepatan
perubahan bakteri.
e. Suhu inkubasi, kebanyakan vakteru tumbuh baik pada suhu 37°C.
f. Wakru inkubasi disesuaikan dengan pertumbuhan bakteri, karena luas daerah
hambat ditentukan bebrapa jam pertama, setelah diinkulasikan pada media
agar, maka daerah hambat dapat diamati segera setwlah adanya pertmbuhan
bakteri.
g. Pengaruh pH, adanya perbedaan pH media yang digunakan dapat
menyebabkan perbedaan jumlah zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan
 jumlah molekul zat uji yang mengion. Selain itu pH berpengaruh terhadap
pertumbuhan bakteri.

2. Sebutkan dan jelaskan metode lain untuk menetapkan kadar antibiotika?

Jawab:
Metode pengenceran (Dilusi)
Sejumlah obat antimikroba tertentu dicampurkan pada perbenihan bakteri
yang cair atau padat. Kemudian perbenihan tersebut ditanami dengan bakteri yang
diperiksa, dan dieram. Titer obat ialah jumlah obat antimikroba yang dibutuhkan
untuk menghambat pertumbuhab atau mematikan bakteri yang diperiksa. Tes
kepekaan pengenceran agar memakan waktu, dan penggunaannya terbatas pada
keadaan khusus. Tes pengenceran kaldu tidak praktis dan jarang digunakan bila
pengenceran harus dibuatkan dalam tabung reaksi namun, adanya serentetan
pengenceran kaldu yang sudah disiapkan untuk berbagau obat dalam lempeng
mikrotiter telah meningkatkan dan msmpermudah cara tersebut. Keuntungan tes
pengenceran kaldu mikrodilusi ialah memungkinkan adanya hasil kuantitatif,
yang menunjukan jumlah obat yang diperlukan untuk menghambat (mematikan)
mikroorganusme yang diperiksa.

H. DAFTAR PUSTAKA
Radji, M. and Manurung, J., 2010. Buku Ajar Mikrobiologi, Panduan Mahasiswa Farmasi
dan Kedokteran, Jakarta: Buku Kedokteran EGC.
Jawetz, E., Melnick, J.l., and Adelberg, E.A., 2001. Mikrobiologi Untuk Profesi Kesehatan
(Review) of Medical Microbiology), Jakarta: Kedokteran EGC.
Iswadi. 2016. Fage Litik Spesifik Escherichia coli Pada Limbah Cair Pasar Tradisional di
Kota Banda Aceh. Jurnal Biotik: 95-99.
Fitri K, S.A., Agung, M.U.K., dan Meika, J. 2015. Larutan McFarland Standar digunakan
sebagai referensi untuk menyesuaikan kekeruhan bakteri suspensi sehingga jumlah
bakteri dalam kisaran yang diberikan untuk membakukan mikroba pengujian. Jurnal
Akuatika: 128-139.