PEMANFAATAN

MIKROORGANISME SEBAGAI
INDIKATOR UJI

Kelompok 11:
Shafra
Tar Purenri Kala
Tarisya Luthfia
 Uji Antibiotik Antimikroba

• Dilakukan dengan cara mengukur respon

pertumbuhan populasi mikroorganisme
terhadap agen antimikroba.
• Tujuan 
• - menentukan potensi dan kontrol kualitas
selama proses produksi senyawa
antimikroba.
• - memonitor dan mengontrol
kemoterapi obat.
Uji Antibiotik Antimikroba

1. Metode Difusi
2. Metode Dilusi
3. Uji Aktivitas Antifungi
4. Uji Aktivitas Antivirus
1. Metode Difusi
• Metode Disc diffusion (Kirby & Bauer)
metode ini digunakan untuk menentukan agen
antimikroba.
Agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan
berdifusi pada media
agar tersebut. Area jernih
mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan
mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan
media agar.
Disc diffusion
1. Metode Difusi
• E-Test
Metode E-Test digunakan untuk mengestimasi MIC (Minimum
Inhibitory Concentration). Yaitu konsentrasi minimal
suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat
mikroba organisme.
pertumbuhan
Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen
antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan
diletakkan pada permukaan media agar yang telah ditanami
mikroorganisme.
Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang
menunjukkan kadar agen antimikroba yang menghambat
pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.
E-test
1. Metode Difusi
• Ditch-plate technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan
pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam
cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji
(maksimum 6 macam) digoreskan ke arah parit yang berisi agen
mikroba
1. Metode Difusi
• Cup-plate technique
Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat
sumur pada media agar yang telah ditanami dengan
mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen
antimikroba yang akan diuji.
1. Metode Difusi
• Gradient-plate technique
• Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar
secara teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar
dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian
dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring.
Nutrisi kedua selanjutnya dihitung di atasnya.
• Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen
antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba
uji (maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari
konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai
panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang
mungkin dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil
goresan.
1. Metode Difusi
• Gradient-plate technique
• Bila: X = panjang total pertumbuhan mikroorganisme yang
mungkin
Y = panjang pertumbuhan aktual
C = konsentrasi final agen antimikroba pada total volume
media mg/mL atau µ/mL,
Maka konsentrasi hambatan adalah: [(X.Y)]: C mg/mL atau
µg/mL.
• Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang
didapat dari lingkungan padat dan cair faktor difusi agen
antimikroba dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media
padat.
2. Metode Dilusi
• Metode dilusi cair/broth dilution tes
(serial dilution)
• Metode ini mengukur MIC dan MBC (minimum inhibitory
concentration atau kadar bunuh minimum,KBM). Cara yang
dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen
antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan
mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang
terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan
sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair
tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan
diunkubasi selama 18-24 jam . media cair yang tetap terlihat jernih
setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM.
2. Metode Dilusi
• Metode dilusi cair/broth dilution tes
(serial dilution)
2. Metode Dilusi
• Metode dilusi padat
• Metode ini serupa dengan metode dilusi cair
namun menggunakan media padat (solid).
Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi
agen antimikroba yang diuji dapat digunakan
untuk menguji beberapa mikroba uji.
3. Uji Aktivitas Antifungi
• Pada uji ini kebutuhan media berbeda dengan uji
menggunakan bakteri.media yang umum digunakan adalah
Sabouroud Dextrose Liquid/solid, Czapex Dox, dan media
khusus fungi lain. Uji ini serupa dengan uji untuk bakteri,
dimana spora fungi atau miselium fungi dilarutkan pada
larutan agen antimikroba uji, dan selanjutnya pada interval
waktu tertentu disubkultur pada media yang sesuai. Setelah
diinkubasi, pertumbuhan fungi pun diamati.
4. Uji Aktivitas Antivirus
• Uji aktivitas antivirus menggunakan kultur jaringan maupun
inokulasi telur berembrio. Campuran antara suspensi virus
dan larutan agen antimikroba uji dibuat dalam seri
pengenceran. Seri pengenceran ini dibuat pada serum yang
telah diinaktivasi, misalnya serum kuda, dan diinokulasikan
pada kultur sel atau telur berembrio. Sebagai kontrol
digunakan larutan tanpa virus. Karena obat juga dapat toksik
pada kultur jaringan atau telur, maka toksisitasnya harus
diuji. Seri pengenceran Obat dicampurkan dengan serum
yang dinaktivasi dan dinokulasi ke dalam sel jaringan atau
telur berembrio. Pengamatan dilakukan setiap hari terhadp
ada atau tidaknya kerusakan sel atau jaringan.
• Selain menggunakan kultur sel atau telur, uji aktivitas
antivirus juga dapat dilakukan pada hewan percobaan,
contohnya pada pengujian virus hepatitis B (HBV) yang tidak
dapat ditumbuhkan pada kultur sel ataupun telurberembrio.
 UJI BIOAUTOGRAFI
Uji bioautografi merupakan metode spesifik untuk
mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang
memiliki aktibitas antibakteri, antifungi, dan antivirus,
sehingga mendekatkan medode separasi dengan uji
biologis.
Keuntungan metode ini adalah sifatnya yang efisien untuk
mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak
dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang
kompleks sehingga memungkinkan mengisolasi senyawa aktif
tersebut. Kerugiannya adalah metode ini tidak dapat digunakan
untuk menentukan KHM dan KBM.
 UJI BIOAUTOGRAFI
Ada dua macam metode bioautografi, yaitu :
• Bioautografi langsung : dengan menyemprot plat KLT
dengan suspensi mikroorganisme ataupun dengan
menyentuhkan plat KLT pada permukaan media agar yang
telah ditanami mikroorganisme. Setelah inkubasi pada
waktu tertentu, letak senuawa aktif tampak sebagai area
jernih dengan latar belakang keruh.
• Bioatografi overlay : Dengan menuangkan media agar
yang telah dicampur dengan mikroorganisme di atas
permukaan plat KLT, media ditunggu hingga padat,
kemudian diinkubasi. Area hambatan dilihat dengan
penyemprotan menggunakan tetrazolium klorida.
Senyawa yang aktif sebagai antimikroba akan tampak
sebagai area jernih dengan latar belakang ungu.
UJI VITAMIN DAN
ASAM AMINO
Uji ini merupakan kebalikan dari uji antimikroba (uji
antibiotik) yang didasarkan pada penghambatan
pertumbuhan mikroorganisme. Assay vitamin dan
asam amino justru didasarkan pada peningkatan
pertumbuhan mikroorganisme. Pada uji ini diperlukan
media kultur bernutrisi yang sesuai untuk mikroba uji,
yaitu memiliki semua faktor pertumbuhan kecuali
faktor yang akan diujikan.
UJI VITAMIN DAN
ASAM AMINO
•Kurva kalibrasi dari konsentrasi substansi uji terhadap
beberapa parameter pertumbuhan mikroorganisme
seperti berat sel kering (BSK) dapat diplotkan sehingga
konsentrasi faaktor pertumbuhan dapat ditentukan.
 UJI AMES
• Uji Ames (Ames test) merupakan uji untuk
mengidentifikasi bahan kimia yang bersifat mutagenik
atau karsinogenik dengan menggunakan bakteri sebagai
indikator kasinogenik. Uji ini didasarkan pada
pengamatanbahwa paparan bakteri mutan terhadap
substansi mutagenikdapat menyebabkan mutasi baru
yang meniadakan efek mutasi asli berupa perubahan
fenotipe, disebut back mutation atau reversion.
• Secara spesifik, uji Ames menguji Salmonella auksotrof
histidin (sel-his) yaitu mutan Salmonella yang
kehilangan kemampuan untuk mensintesis histidin,
menjadi sel his+ setelah perlakuan dengan bahan
mutagenik.
 UJI AMES
• Bahan kimia harus diaktivasi ( diubah secara kimia kedalam bentuk kimia yang
relatif ) dengan menggunakan enzim hewani agar aktivitas atau karsinogenik
dapat muncul. Bahan kimia uji dan bakteri mutan diinkubasi bersama-sama
dengan ekstrak hati tikus yang kaya enzim aktivasi. Bila bahan kimia yang diuji
bersifat mutagenik, akan terbentuk reversi bakteri his- menjadi his+ . jumlah
revertant yang terbentuk mengindikasikan derajat mutagenik atau
karsinogenikbahan kimia yang diuji

• Penyempurnaan lebih lanjut terhadap uji Ames memungkin penyaringan

bahan-bahan yang memerlukan aktivitas metabolik sebelum motagenitas
bahan-bahan itu tampak. Hal ini bisa dilakukan dengan menggabungkan pada
lapisan agar bagian atas, bersama dengan bakteri tersebut, homogenat hati
tikus ( atau manusia ) yang sistem enzim pengaktivasinya telah dimunculkan
dengan pengeksposan pada campuran bifenil yang telah mengalami
poliklorinasi. Uji ini kadang-kadang disebut pengukuran Salmonella atau
mikrosom karna menggunakan fraksi-fraksi homogenat hati yang disebut
fraksi S9dan mengandung banyak mikrosom hati.
 PEGGUNAAN MIKROORGANISME
SEBAGAI MODEL METABOLISME
OBAT MAMALIA
• Keamanan dan kemanjuran obat harus dievaluasi secara luas sebelum
digunakan untuk mengobati penyakit pada manusia. Penelitian terhadap cara
obat dimetabolisasi sangat bermanfaat karena penelitian semacam ini
menyediakan informasi tentang cara aksi obat, mengapa obat menunjukkan
toksisitas, serta bagaimana obat didistribusikan, diekskresikan, dan disimpan
didalam tubuh. Secara tradisonal, penelitian metabolisme obat menggunakan
model binatang, dan sampai pada batas tertentu, menggunakan preparasi
mikrosomal hati, kultur jaringan dan sistem organ tertentu. Masing-masing
model ini memiliki kekurangan dan kelebihan tertentu dan terdapat tekanan
cukup besar dari kelompok-kelompok pemerhati binatang untuk
menghentikan penggunaan binatang pada penelitian ilmiah.
• Penggunaan sistem mikrobial sebagai model  in vitro untuk metabolisme obat
pada manusia disebabkan oleh adanya banyak kesamaan diantara sistem
enzim mikrobial tertentu dan sistem enzim hati mamalia. Kelebihan utama
penggunaan mikroorganisme adalah kemampuannya untuk menghasilkan
jumlah metabolit yang signifikan, sebaliknya hal tersebut sulit diperoleh dari
sistem binatang atau sintesis kimiawi. Selain itu, penggunaan mikroorganisme
dapat mengurangi biaya operasional penelitian bianatang.
PEGGUNAAN MIKROORGANISME SEBAGAI
MODEL METABOLISME OBAT MAMALIA
• Penelitian metabolisme obat mikrobial biasanya diawali menapis
(skrining) sejumlah besar mikroorganisme untuk mengetahui
kemampuannya dalam mitabolisme suatu substrat obat. Sebagai
substrat biasnya ditumbuhkan pada media seperti glukosa pepton
pada tabung labu yang digoyang-goyang untuk memberikan
aerasi yang baik. Obat sebagai substrat biasanya ditambahkan
setelah pertumbuhan 24 jam, kemudian diambil sebagai sampel
untuk mengetahui adanya metabolit dengan interval tertentu
sampai 14 hari setelah penambahan substrat. Tidak lama lagi
setelah ditentukan bahwa suatu mikroorganisme memetabolisme
obat, proses secara keseluruhan dapat diperbesar sklalanya  untuk
prduksi sejumlah besar metabolit menentukan struktur dan sifat-
sifat biologisnya.
SEKIAN & TERIMA KASIH