BABI

PENDAHULUAN

Virologi adalah ilmu yang mempelajari virus dan penyakit – penyakit yang
ditimbulkannya. Untuk menegakkan diagnose virus, biasanya ditunjang dari hasil
pemeriksaan Laboratorium.

Cara pengolahan, pengawetan, pengemasan dan pengiriman bahan pemeriksaan

harus dilakukan sebaik-baiknya agar mendapatkan hasil yang dapat dipertanggung
jawabkan.

Cara pemeriksaan virus yang umum dilakukan di Laboratorium antara lain meliputi :

1. Mikroskopis
2. Isolasi identifikasi
3. Serologi

A. Alat – alat yang diperlukan Laboratorium virologi.

1. Centrifuge biasa, centrifuge suhu dingin dan centrifuge kecepatan tinggi.
2. Tabung serologi, rak tabung serologi.
3. Plastic Plate.
4. Lemari es biasa, deepfreezer suhu -20oC dan -70oC.
5. Penangas air 37oC dan 56oC – 65oC.
6. Lemari pengeram 35oC dan 37oC.
7. Timbangan.
8. Lampu sorot telur.
9. Bor telur.
10. Mikroskop biasa, mikroskop phase kontras dan mikroskop fluorescent.
11. Spuit.
12. Sterilisator kering dan basah.

B. Sterilisasi alat.
Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat – alat atau bahan – bahan
dari segala macam bentuk kehidupan, terutama mikroba.

1
 Seperti diketahui, penyelidikan suatu spesies mikroba selalu didasarkan atas
penyelidikan sifat biakan murni spesies, oleh karena itu untuk dapat memisahkan
kegiatan mikroba – mikroba satu dengan mikroba lainnya atau untuk memelihara suatu
mikroba secara biakan murni, perlu dipergunakan alat – alat dan medium yang steril.
Dalam praktek sterilisasi alat atau medium dapat dikerjakan secara mekanik
misalnya penyaringan dan secara kimia misalnya disinfektan atau secara fisik misalnya
dengan pemanasan, sinar ultra violet, sinar X, dan lain –lain.
Cara sterilisasi yang dipakai tergantung pada macamnya bahan dan sifat bahan
yang disterilkan (ketahanan terhadap panas bentuk bahan yang disterilkan : padat, cair
dan gas ).

Sterilisasi yang banyak digunakan di Laboratorium virologi antara lain :

1. Sterilisasi dengan udara panas (kering).

Untuk sterilisasi dengan udara panas diperlukan alat yang disebut oven. Alat
sterilisasi ini dipakai untuk mensterilkan alat – alat gelas seperti erlenmeyer, tabung
reaksi, dan alat- alat gelas yang lain. Bahan – bahan seperti kapas, kain dan kertas
dapat disterilkan dengan alat ini tetapi dalam batas – batas tertentu. Pada umumnya
temperatur yang digunakan pada sterilisasi secara kering adalah 170oC – 180oC selama
2 jam.

2. Sterilisasi dengan uap air panas.

Bahan – bahan yang mengandung cairan jarang disterilkan dengan udara panas
yang kering, untuk sterilisasinya yang paling baik adalah dengan menggunakan uap air
panas.

3. Sterilisasi dengan menggunakan uap air panas jenuh.

Alat yang digunakan untuk sterilisasi dengan uap panas jenuh ialah autoclave. Alat
ini terdiri atas suatu bejana tahan tekanan tinggi yang dilengkapi dengan manometer,
termometer dan klep pengatur suhu. Sterilisasi dengan autoclave merupakan sterilisasi
yang paling baik, jika dibandingkan dengan cara – cara sterilisasi lainnya.

2
C. Bahan pemeriksaan untuk mendiagnosa penyakit virus.

Bahan pemeriksaan yang diterima di Laboratorium terutama untuk isolasi virus adalah
air cucian tenggorok, air ludah, faeces, nanah, keropeng, darah, serum dan otak.Bahan
– bahan pemeriksaan ini harus diolah dahulu sesuai dengan bahan pemeriksaan
sebelum disuntikan pada hewan percobaan, telur berembrio atau di tanam pada biakan
jaringan.

a. Pengambilan bahan pemeriksaan.

Pengambilan bahan pemeriksaan sebaiknya diambil pada waktu 1-3 hari dari
penyakitnya.

1) Makula dan Papula

- Kerok makula atau papula dengan pisau.
- Hasil kerokan dikumpulkan dalam tabung steril.
- Kemudian dibuat preparat.
2). Vesikula dan Pustula
- Tusuk vesikula atau pustula dengan pipet pasteur.
- Masukkan isi vesikula atau pustula kedalam tabung kapiler.
-Tutup kedua ujungnya.
- Dasar vesikula atau pustula dikerok.
- Hasil kerokan dikumpulkan dalam tabung.
-Kemudian buat preparat.
3). Keropeng
- Ambil keropeng dengan pinset.
- Kumpulkan dalam tabung steril.
4). Sekret mata
- Ambil sekret mata dengan swabs.
-Masukkan ke dalam tabung yang berisi bouillon.
5). Sputum
- Masukkan sputum dalam botol steril yang ditutup rapat.
6). Faeces
- Masukkan sekitar 5 gram faeces dalam steril yang bertutup rapat.
7). Liquor
-Ambil sebanyak 5-10 mL liqour.

3
 -Masukkan ke dalam botol steril tertutup rapat.
-Simpan dalam lemari es.
8). Jaringan otak
-Masukkan jaringan otak dalam larutan glyserin 50% atau dalam larutan NaCl
0,85%.
9). Darah
-Ambil darah dengan spuit.
-Masukkan kedalam botol steril.

b. Pengiriman bahan pemeriksaan.

Semua bahan pemeriksaan harus diterima dalam botol atau tabung yang steril.
Pada umumnya bahan pemeriksaan harus dikirim cepat dan dalam keadaan yang dingin
sedangkan bahan pemeriksaan yang berasal dari penderita cacar baik itu macula,
keropeng atau pun faeces tidak perlu dingin. Darah untuk pemeriksaan serologi tidak
boleh dikirim dalam keadaan beku dan sebaiknya tiba di Laboratorium dalam waktu 24
jam setelah pengambilan bahan atau serumnya dipisahkan terlebih dahulu dan dibubuhi
larutan merthiolate 1/2500 sebanyak 1 tetes pada 1 mL serum.

Pengiriman bahan pemeriksaan biasanya harus disertai keterangan klinis yaitu

dari permulaan sakit, penyakit yang diduga, gejala-gejala penyakit, nama penderita,
tempat tinggal dan tanggal pengambilan bahan.

4
 B A B II
CARA – CARA PEMERIKSAAN VIRUS

A. Pemeriksaan Mikroskopis.

Pemeriksaan mikroskopis mempunyai nilai paling rendah, karena tidak dapat

mengetahui dengan pasti jenis virusnya, tetapi mempunyai nilai paling tinggi untuk
pemeriksaan virus Rabies karena virus Rabies mempunyai Inclusion bodies (Negri
Bodies) dalam sel otak. Inclusion bodies juga terdapat dalam diagnosa demam kuning
(Yellow Fever) dalam sel- sel hati.

Preparat untuk diagnosa virus ini harus baik dan dibuat tipis dan untuk fiksasi dalam
pembuatan coupes umumnya digunakan larutan Zenker, yang kemudian diwarnai
sesuai dengan jenis preparat.

Pewarnaan yang paling banyak digunakan dalam virologi ini antara lain :

1. Pewarnaan Giemsa.
2. Pewarnaan Gispen.
3. Pewarnaan Seller.
4. Pewarnaan Machiavello.
5. Pewarnaan Gastaneda.

1. Pewarnaan Giemsa

a. Alat – alat :
- Gelas sediaan
- Pipet Pasteur
- Ose
b. Bahan :
- Asam asetat glasial 7,5% dalam formalin 40%
- Larutan Giemsa
Isi larutan Giemsa :
- 8 tetes giemsa stock
- 5 mL Aquadest

5
 c. Cara Kerja : - Buat preparat hapus tipis dan keringkan.
- Tetesi dengan asam asetat glacial 7,5%.
- Cuci dengan air.
- Tetesi dengan larutan giemsa.
- Panaskan hingga keluar uap biarkan 10 menit.
- Panaskan lagi dan biarkan selama 10 menit.
- Cuci dengan air dan keringkan di udara.
- Periksa di bawah mikroskop dengan memakai objektif 100
kali.

d. Hasil : Untuk virus Rikettsia berwarna ungu dengan warna dasar ungu
muda.

2. Pewarnaan Gispen

a. Alat – alat : - Gelas Ukur

- Pipet Ukur
- Coupling jar
- Erlenmeyer 100 mL
- Ose
b. Bahan : a). Larutan A
- Asam Asetat Glasial 1 mL
- Formalin 40% 2 mL
- Aquadest 100 mL

b). Larutan B

- Fenol 1 gram
- Tanin 5 gram
- Aquadest 100 mL

c). NH4OH 1% dan 25%

d). AgNO3 10%

e). Larutan perak

f). Xylol
6
  Pembuatan Larutan Perak:
- Bersihkan Erlenmeyer 100 mL, lalu buang airnya maka akan ada sisa air yang
tertinggal.
- Tetesi NH4OH 25% sebanyak 1 ose.
- Masukkan AgNO3 10% dengan pipet 0,5 mL.
- Tambahkan aquadest sebanyak 20 mL.(maka akan ada endapan putih dari AgOH).
- Endapan tersebut encerkan dengan aquadest.
- Titrasi dengan NH4OH 1% (biasanya 1,4 – 1,8 mL).
- Hasil titrasi larutan berubah jadi jernih.
- Tetesi dengan AgNO3 10% tetes sehingga akan berbentuk warna perak.

c. Cara Kerja :
- Buat preparat hapus yang tipis kemudian keringkan.
- Tetesi dengan Larutan A, biarkan 1 menit.
- Cuci dengan air dan keringkan di udara.
- Masukkan preparat dalam coupling jar yang berisi xylol dan biarkan selama 5 menit.
- Keringkan di udara, bila perlu cuci dengan aquadest.
- Tetesi dengan larutan B, kemudian panaskan sampai keluar uap dan biarkan 1 menit.
- Cuci dengan air kran dan bilas dengan aquadest.
- Tetesi larutan perak kemudian panaskan sampai keluar uap dan biarkan selama 2
menit.
- Cuci dengan air kran lalu keringkan.
- Lihat di bawah mikroskop.

d. Hasil :
- Elementari bodies berwarna coklat tua dengan dasar kuning muda.
- Bentuk bulat, diameter 1/3 Staphylococcus.

3. Pewarnaan Seller

a. Alat –alat : - Gelas sediaan.

- Pinset.
- Ose.

7
 b. Bahan : - Larutan A  Basic fuchsin 1% dalam alcohol.
- Larutan B  Methylen Blue 1% dalam alcohol.
- Campuran larutan A dan larutan B (1 bagian larutan A
dan 2 bagian larutan B lalu disaring).
Atau Campuran lain :
- Larutan A  Methylen Blue 2% dalam alcohol.
- Larutan B  Basic Fuchsin 4% dalam alcohol.
- Campuran larutan A dan larutan B (3 bagian larutan A
dan 1 bagian larutan B lalu disaring).

c. CaraKerja : - Buat preparat sentuh atau preparat hapus.

- Fiksasi dengan Methanol selama 5 menit.
- Cuci dengan air.
- Celupkan dalam zat warna Seller 3-7 detik.
- Cuci dengan air dan keringkan di udara.
- Periksa di bawah mikroskop.

d. Hasil : Negri Bodies berwarna merah di dalam sitoplasma sel syaraf

dengan warna dasar biru muda dan inti sel berwarna biru tua. Inti sel

Negri bodies
Sel syarat

Gambar 1.
Mikroskopis preparat
rabies

4. Pewarnaan Machiavello

a. Alat – alat : - Gelas sediaan.

- Ose.

b. Bahan : - Basic Fuchin 0,25% dalam aquadest.

8
 - Asam sitrat 0,25 – 0,50% dalam aquadest.
- Methylen Blue 1% dalam aquadest.

c. Cara Kerja : - Buat preparat hapus tipis dan keringkan.

- Fiksasi dengan api.
- Tetesi basic fuchsin dan biarkan 3-5 menit.
- Buang sisa basic fuchsin lalu celupkan dalam asam sitrat
dan biarkan selama 2-5 detik.
- Cuci dengan air.
- Tetesi Methylen Blue dan biarkan 1 menit.
- Cuci lagi dengan air dan keringkan di udara.
- Periksa di bawah mikroskop.

d. Hasil : Elementari bodies berwarna merah/biru.

5. Pewarnaan Castaneda

a. Alat – alat : - Gelas sediaan.

- Ose.

b. Bahan : - Larutan Mordan Lueis.

Isinya :

- 100 mL formalin
- Asam asetat glasial 7,5 mL.

- Larutan Formal Blue.

Isinya :
- Larutan Buffer fosfat pH 7 90 mL
- Azzur II 1% dalam Meth. Alk. 10 mL
- Formalin 5 mL
- Larutan Safranin 0,25% dalam aquadest.

9
 c. Cara Kerja : - Buat preparat hapus tipis dan keringkan.
- Fiksasi dengan Mordan Lueis.
- Cuci dengan air.
- Warnai dengan larutan formal blue 10 menit.
- Cuci dengan air.
- Warnai dengan safranin 5 – 10 detik.
- Cuci dengan air dan keringkan di udara.
- Periksa di bawah mikroskop dengan menggunakan
objektif 100 kali.

d. Hasil : Untuk virus Rikettsia berwarna Biru.

B. Isolasi
Virus yang diisolasi dari penderita kadang – kadang bukan yang menyebabkan
penyakit, misalnya virus poliomyelitis dan enterovirus seringkali terdapat pada anak yang
sehat atau yang menderita penyakit lain. Virus Herpes yang diisolasi dari vesicel pada
bibir seorang penderita dengan gejala demam panas seringkali hanya sebagai gejala
penyerta penyakit lain saja. Oleh karena itu virus yang diisolasi dari seorang penderita
harus dibuktikan apakah betul penyebab penyakitnya yaitu dengan cara tes serologi
terhadap sera penderita. Adanya kenaikkan titer antibodi dalam darah penderita
terhadap virus yang baru diisolasi tadi adalah bukti bahwa virus itu penyebab
penyakitnya.
Isolasi dapat dilakukan dengan cara :
1. Menggunakan hewan percobaan (tikus, marmut, kelinci, kera).
2. Penanaman pada telur berembrio umur 5 – 7 hari : 11 – 13 hari dan 13 – 14 hari.
3. Menggunakan biakan jaringan ginjal kera, ginjal kelinci dan amnion manusia dari
berbagai cell lines.

Bahan pemeriksaan yang biasa diterima dalam Laboratorium untuk isolasi adalah :

- Air air cucian tenggorok

- Faeces
- Keropeng
- Liquor cerebrospinalis (air sumsum)

10
- Ludah
- Nanah
- Darah
- Otak

Bahan – bahan pemeriksaan ini masing – masing harus diolah dahulu dengan cara
tersendiri sebelum disuntikkan pada hewan percobaan, telur atau ditanam pada biakan
jaringan seperti di bawah ini.

 Pengolahan air cucian tenggorok dan air ludah.

- Tambah 0,05 mL penstrep yang mengandung penilicin 100.000 unit/mL dan
streptomycin 250.000 unit/mL pada tiap – tiap 0,9 mL air cucian tenggorok atau air
ludah.
- Eramkan pada suhu 4oC selama 1 jam.
- Putar Selama 20 menit dengan kecepatan 3.000 rpm.
- Pisahkan supernatan yang akan ditanam/ disuntikkan.
 Pengolahan faeces.
- Buat emulsi 10% dari 1 gram faeces dalam larutan Hank’s dalam mortir atau dalam
botol dengan butir – butir gelas yang dapat ditutup rapat dan dikocok.
- Putar 15 menit dengan kecepatan 3.000 rpm.
- Diamkan selama 1 jam pada suhu 4oC – 6oC.
- Pindahkan supernatan dalam tabung plastik yang sudah disterilkan dan tutup
dengan kertas steril.
- Putar selama 1 jam dengan kecepatan 10.000 rpm.
- Pindahkan supernatan ke dalam tabung tabung sebanyak 2 mL.
- Tambahkan 0,1 mL larutan penstrep yang mengandung 100.000 unit penicilin dan
250.000 ug. Streptomycin/mL pada 2 mL supernatan.
 Pengolahan Keropeng.
- Buat suspensi 20% bahan keropeng atau darah dengan Hank’s solution dalam
mortir, gerus baik – baik.
- Putar selama 15 menit dengan kecepatan 2.000 rpm.
- Pisahkan supernatan dengan pipet pasteur.
- Tambahkan 0,1 mL larutan penstrep 100.000 unit penicilin dan 250.000 ug.
Streptomycin/mL seperti di atas per 2 mL supernatan.

11
  Pengolahan Nanah atau air kelembung.
- Tambahkan 1 mL air garam physiologis atau Hank’s solution yang mengandung
1.000 unit penicillin dan 2.500 ug. Streptomycin pada 0,1 – 0,2 mL nanah dan air
kelembung itu.
 Pengolahan Otak dan jaringan lain.
- Buat emulsi 10-20% dengan Hank’s solution yang mengandung penstrep 1.000 –
2.500 ug/mL.
- Putar selama 15 menit dengan kecepatan 3.000 rpm.
- Pisahkan supernatantnya.
 Pengolahan rectum dan hapus tenggorokan.
- Tambahkan 2 mL larutan Hank’s yang mengandung penstrep 1.000 – 2.500 ug/mL.
- Kocok dan buang hapusnya.
- Putar selama 1 jam dengan kecepatan 10.000 rpm.
- Pisahkan supernatant dengan pipet Pasteur.
- Tambah 0,1 mL larutan penstrep 100.000 – 250.000 ug/mL.
 Pengolahan Bahan Nyamuk.
- Masukkan sekitar 50 nyamuk ke dalam mortir yang steril dan gerus baik – baik.
- Tambah 4 mL larutan 0,75% Bovin albumin dalam 1/100 M buffer phosfat – air
garam 0,85% pH 7,2 yang mengandung penstrep 500 ug/mL.
- Putar selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.
- Pisahkan supernatan dengan pipet pasteur.

1. Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan dalam isolasi biasanya berbeda – beda baik jenis hewan
yang digunakan, jenis kelamin, umur dan juga cara penyuntikannya. Hal ini tergantung
jenis virus yang akan diisolasi. Contoh hewan yang sering digunakan untuk percobaan
adalah kera, kelinci, marmot, dan tikus.
a. Cara penyuntikan hewan percobaan
Cara penyuntikan hewan percobaan ada beberapa cara tergantung jenis hewan
percobaan yang akan digunakan. Penyuntikan tersebut bisa dengan cara sub cutan,
intra cutan, intra muscular, intra peritonial, intra cerebral dan intra venus.
1). Penyuntikan tikus dewasa.
Cara sub cutan, intra muscular, intra peritonial.
- Pegang tikus dengan tangan kanan pada bagian ekornya.

12
 - Tarik sedikit, lalu pegang batang lehernya dengan tangan kiri.
- Balikkan tikus hingga posisi ada di tangan kiri.
- Pegang ekornya dengan jari kelingking.
- Suntik :

Sub cutan:

 Lokasi penyuntikan pada dinding perut.

 Bahan yang disuntikan sebanyak 0,5 mL.

Intramuscular :

 Lokasi penyuntikan pada paha.

 Bahan yang disuntikan sebanyak 0,2 mL.

Intraperitonial :

 Lokasi penyuntikan di tengah perut antara pusat dan ujung tulang dada.
 Bahan yang disuntikan sebanyak 0,2 mL.

Gambar 1. Lokasi Penyuntikan Tikus

Cara intracerebral.

 Sediakan stoples dengan alas dari seng dan kayu.

 Simpan kapas yang dibasahi dengan ether di bawah alas.
 Masukkan tikus, bila tikus sudah tertidur angkat keluar.
 Letakkan tikus dengan posisi tidur miring.
 Pegang kepala tikus dekat batang lehernya dengan telunjuk dan ibu jari yang
menahan rahang bawah tikus. Ekor tikus, tubuh dan kakinya dijepit dengan jari
yang lain, hingga tikus tidak dapat bergerak.
 Suntik tikus di antara mata dan telinga sebanyak 0,03 mL.

13
 

Gambar 2. Cara penyuntikan intracerebral tikus dewasa.

Cara intravenus.

 Sediakan kotak atau tabung dari plastik atau gelas yang sempit supaya tikus tidak
dapat bergerak banyak.
 Tarik ekor tikus keluar dari kotak.
 Suntik ke dalam vena di daerah ekor sebanyak 0,4 mL.

Gambar 3. Cara penyuntikan intravenus tikus dewasa.

2). Penyuntikan tikus bayi.

Cara intracerebral.

 Pegang dengan pinset perlahan – lahan kepala tikus bayi.

 Suntik antara telinga dan mata sebanyak 0,01 – 0,02 mL.

Cara Sub cutan, intra muscular dan intraperitonial.

 Pegang tikus dengan pinset atau dengan kertas saring (jangan dengan tangan
karena mungkin sekali ibu tikus – tikus bayi akan menunjukkan kanibalisme dan
makan anak – anaknya sendiri bila tikus – tikus bayi itu berbau tangan manusia).

14
  Suntik sub cutan, intramuscular dibagian punggung dengan jarum yang kecil (no.
25-27) sebanyak 0,1 mL.
 Suntik intraperitonial seperti tikus dewasa tempatnya sebanyak 0,1 – 0,2 mL.

Cara intracerebral.

 Pegang dengan pinset perlahan – lahan kepala tikus bayi atau dengan jari – jari
yang dilapisi dengan kertas saring.
 Suntik antara telingan dan mata sebanyak 0,01 – 0,02 mL.

3). Penyuntikan Kera.

Sub cutan dan intra cutan

 Sangat baik dilakukan di punggung hingga kera tidak dapat menggaruknya.

Intra muscular.

 Dilakukan pada bagian pahanya.

Intra cerebral.

 Dilakukan sama seperti pada marmot dan kelinci.

4). Penyuntikan Marmot.

Sub cutan dan intra Muscular dan intraperitonial.

 Pegang marmot dengan tangan kiri hingga tidak dapat bergerak.

 Suntik :Sub cutan  Pada dnding perut sebanyak 4-5 mL.

Intramuscular  Pada bagian paha sebanyak 0,5 – 1 mL.

Intraperitonial  Di atas perut sebanyak 2 – 5 mL.

Intra cerebral.

 Masukkan marmot kedalam kotak yang ada lubangnya.

 Keluarkan hanya bagian kepalanya saja.
 Belah kulit kepala sepanjang 1 cm di tengah – tengahnya.

15
  Tarik kulit kepala yang telah dibelah itu ke samping hingga garis belahan terletak
di antara telinga dan mata.
 Bor tulang kepalanya dengan alat pengebor kecil diameter 1-2 mm.
 Suntik sebanyak 0,2 mL ke dalam otaknya.
 Lepaskan kulit kepala dan tutup lukanya dengan plester.

5). Penyuntikan Kelinci.

Intra venus.

 Bersihkan rambut telinga kelinci di tempat yang akan disuntik.

 Desinfektan dengan alkohol.
 Gosok kulit dengan xylol hingga urat darah melebar.
 Suntik pada ujung telinga.

2. Telur Berembrio.
Telur berembrio yang dipakai untuk isolasi bisa digunakan telur ayam negeri, ayam
kampung dan bebek. Umur telur, cara penyuntikan, suhu pengeraman dan lamanya
pengeraman berbeda – beda tergantung jenis virus yang akan diisolasi.
Ada empat cara penyuntikan telur berembrio yaitu:
a. Intra Yolksac
b. Intra Alantois
c. Intra Amnion
d. Pada selaput chorio allantois (drooping chorio allantoismembrane).

Cell Air Sac

Allantoic caity

Embryo Amniotic Cavity

Extraembrional cavity Yolk Sac

Chorionallantoic Membrane
Albumin

Gambar 4. Struktur telur berembrio

16
Intra Yolksac.

 Sediakan : - telur berembrio yang berumur 5 -7 hari.

- Bor telur

- disposible syringe 1 mL

- cellotipe

- gunting steril.

 Lihat telur dalam ruangan gelap, beri tanda ruang udara.

 Bor di tengah – tengah ruang udara.
 Suntikan bahan sebanyak 0,5 – 1 mL.
 Tutup bagian ruang udara yang disuntik dengan cellotipe.
 Eram pada suhu 37oC selama 3 hari dengan posisi berdiri.

Gambar. 5.

Gambar 6.Penyuntikan intra yolksac.( Yolk Inoculation )

Cara pembongkaran telur :

- Gunting lubang pada ruang diameter sekitar 1 cm dengan gunting steril.

- Robek selaput putih telur.
- Isap cairan amnionnya.

17
- Isap kuning telurnya untuk diperiksa.

Intra Allantois.

 Sediakan : - telur berembrio yang berumur 9-11 hari.

- bor telur

- disposible syringe 1 mL.

- cellotipe

- gunting steril

- pipet pasteur

 Lihat telur dalam ruangan gelap, beri tanda ruang udara dan daerah tampaknya
mata embrio.
 Bor pada tempat 1-2 mm di atas batas ruang udara.
 Suntikan bahan sebanyak 0,1 – 0,2 mL.
 Tutup bekas penyuntikkan dengan cellotipe.
 Eram pada suhu 37oC selama 3 hari dengan posisi berdiri.

Gambar 5.

Gambar 7.
Peyuntikkan intra allantois.

Cara pembongkaran telur.

- Buat lubang pada rung udara dengan diameter 1-2 cm.

- Tusukkan pipet pasteur melalui lubang tersebut.
- Isap cairan allantoisnya melalui selaput kulit telur.
- Kumpulkan pada tabung yang steril.

18
 a b

Gambar 8. a) Pembongkaran telur, b) cara merobek selaput putih telur,

c) pemipetan cairan Allantois

Intra Amnion.

 Sediakan: - telur berembrio yang berumur 13-14 hari.

- bor telur

- disposible syringe 1 mL

- cellotipe

- gunting steril

 Lihat telur dalam ruangan gelap, beri tanda ruang udara.

 Buka ruangan udaranya.
 Teteskan 2-3 tetes minyak mineral pada selaput kulit telur yang membentang
sebagai dasar ruangan udara, sehingga menjadi transparan (embrio dapat
terlihat).

19
  Isap bahan dengan spuit kemudian tarik spuit yang sudah mengandung bahan
tersebut sehingga udara masuk ke dalam spuit.
 Penyuntikan diarahkan ke mata embrio atau di bawah sayap embrio (ruang
amnion), yang disuntikan hanya udaranya saja, sehingga akan tampak
gelembung udara dan spuit jangan dicabut, (bila tidak ada gelembung udara
berarti penyuntikan salah).
 Suntikan bahan 0,1-0,2 mL.
 Tutup lubang dengan cellotipe.
 Eram pada suhu 37oC selama 3 malam dengan posisi berdiri.

Gambar 9.Penyuntikan intra amnion.

Cara pembongkaran telur.

- Buka tutup cellotipe pada ruang uadra.

- Robek selaput kulit telur dengan pipet Pasteur.
- Tusuk menembus ke arah allantois lalu isap dan masukkan ke dalam tabung.
- Baringkan telur, keluarkan embrio yang dikelilingi kantong yang jernih sampai
menonjol keluar.
- Isap cairan amnionnya sampai habis.

Pada selaput chorio allantois (drooping CAM).

 Sediakan : - telur berembrio yang berumur 11-13 hari

- bor telur

- disposible syringe 1 mL

- cellotipe

20
 - gunting steril.

 Lihat telur dalam rungan gelap, beri tanda pada ruang udara, pada embrio dan
pada tempat yang tidak ada pembuluh darah.
 Bor bagian ruang udara sampai menusuk selaput kulit telur.
 Bor pada bagian yang tidak ada pembuluh darahnya, jangan sampai selaput kulit
telur tertusuk.
 Teteskan NaCl 0,85% steril di atas daerah yang tidak ada pembuluh darahnya.
 Isap dengan pengisap karet dari lubang di tengah – tengah ruang udara, hingga
tetesan NaCl itu terhisap ke dalam.
 Lihat telur di ruang gelap untuk mengetahui apakah selaput chorio allantonis telah
turun dan ruangan udaranya sudah tidak tampak lagi.
 Ambil bahan dengan spuit sebanyak 0,1-0,2 mL.
 Tusukkan pada luban lubang ke bagian CAM.
 Tutup lubang – lubang dengan cellotipe.
 Eramkan pada suhu 37oC selama 3 malam dengan posisi terbaring.

Gambar 10.Penyuntikan pada selaput chorio allantois membran.

Cara pembongkaran telur.

- Ambil telur dengan posisi terbaring.

- Buka cellotipe yang menuntut lubang ruang udara.
- Masukkan salah satu ujung gunting ke dalam lubang tersebut.
- Gunting sekelilingnya sehingga semua isi telur akan jatuh dan yang tersisa tinggal
CAM.
- Balikkan CAM yang tersisa, ambil dengan pinset.
- Periksa adanya pock atau plaque.

21
3. Biakan Jaringan

Biakan jaringan yang digunakan untuk isolasi bisa dari jaringan manusia atau jaringan
hewan. Jaringan normal manusia yang biasa dibuat adalah :
- preputinum
- otot
- selaput amnion
- otot

sedangkan jaringan yang berasal dari jaringan yang tidak normal adalah dari jaringan
tumor baik yang ganas maupun yang tidak ganas.

Cara pemeriksaan :

- Sediakan tabung – tabung biakan jaringan yang umurnya 5-7 hari.

- Cuci dengan larutan Hank’s sebanyak 3 kali.
- Tanam 4 tabung masing – masing dengan 0,1 – 0,2 mL bahan virus.
- Tambah masing – masing tabung dengan 1-2 mL medium.
- Eramkan pada suhu 36oC-37oC selama 1-2 minggu.
- Periksa adanya cpe.
C. Pemeriksaan Serologi

Pemeriksaan serologi paling banyak digunakan dalam diagnose penyakit virus

karena murah dan mudah dilakukan. Dalam pemeriksaan serologi ini biasanya diperiksa
sepasang serum dari penderita yaitu serum yang di ambil pada masa sakit dan yang di
ambil pada 2 minggu kemudian yaitu pada masa konvalescens. Bila titer serum naik
sekurang – kurangnya 4 kali maka mungkin sekali penderita diserang oleh virus sejenis
dengan antigen yang digunakan dalam tes serologi itu.

Pemeriksaan serologis yang sering digunakan dalam diagnose penyakit virus

adalah :

a) Tes penghambatan hemaglutinasi.

b) Tes Presipitasi.
c) Tes Netralisasi.
d) Tes Fluorescensi Antibodi Test (FAT).
e) Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA).

22
a.Tes penghambatan Aglutinasi

Tes ini berguna untuk :

1). Menentukan kenaikan titer serum I (akut) terhadap titer serum II (Konvalescens).

2). Menentukan tipe virus yang menyebabkan sakit.

Prinsip pemeriksaan :

1. Tes hemaglutinasi
Virus (antigen) + eritrosit  terjadi hemaglutinasi. Makin tinggi pengenceran virus,
makin berkurang daya virus untuk menyebabkan terjadinya hemaglutinasi.
2. Tes penghambatan hemaglutinasi
Virus (antigen) + anti serum spesifik + eritrosit akan terjadi penghambatan
hemaglutinasi. Makin tinggi pengenceran serum, makin berkurang daya anti serum
untuk menghambat terjadinya hemaglutinasi.

Contoh pemeriksaan :

Menentukan kenaikan titer serum terhadap virus Influenza.

Bahan – bahan : - NaCl 0,85%

- Eritrosit ayam 0,5%

- Antigen Influenza
- Serum I (akut)
- Serum II (konvalescens)

Alat – alat : - Tabung serologi

- Rak tabung serologi

- Mat pipet

Cara kerja :

1. Membuat eritrosit ayam 0,5%

2. Menentukan titer antigen
3. Menentukan kenaikan titer serum

Cara membuat eritrosit ayam 0,5%

23
 - Masukkan 2 mL Natrium sitrat3,8% ke dalam spuit.
- Isap darah vena ayam ( di bawah sayap) sampai 10 mL.
- Masukkan dalam tabung cetrifuge.
- Putar 2000 rpm selama 10 menit.
- Buang plasmanya, kemudian endapan eritrositnya dicuci dengan NaCl 0,85%
sebanyak 3 kali.
- Endapan eritrosit dibuat konsetrasi 10%.
- Kemudian buat eritrosit dengan konsetrasi 5%.

Menentukan titer antigen dengan tes hemaglutinasi.

- Buat pengenceran antigen 2 kali lipat dengan NaCl 0,85% (1/2, 1/4, 1/8, 1/6,
1/32..........dst)
- Masukkan masing – masing pengenceran sebanyak 0,2 mL ke dalam tabung.
- Tambahkan pada tiap tabung 0,4 mL eritrosit ayam 0,5%.
- Kocok, diamkan selama 1 jam pada suhu kamar.
- Lakukan pula kontrol eritrosit sebagai berikut :Pada sebuah tabung isi dengan 0,4
mL NaCl 0,85% dan 0,4 mL eritrosit ayam 0,5%.

Pengamatan :

Setelah di diamkan selama 1 jam, baca pada pengenceran berapa terjadinya aglutinasi
total.

- Bila terjadi hemaglutinasi (+)  Eritrosit menyebar pada dasar tabung

- Bila terjadi hemaglutinasi (-)  Eritrosit berkumpul di tengah dasar tabung dan
bergerak bila digoyang.

Kontrol eritrosit harus negatif (-), berarti tidak terjadi hemaglutinasi sendiri.

Bila eritrosit hasilnya negatif, kemudian baca hasilnya pada deret pemeriksaan.

24
 Contoh pembacaan :

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 CE

+ + + + + - - -

Maka titer antigen (titer 1 U HA) = 1/32

Menentukan kenaikan titer serum dengan tes penghambatan hemaglutinasi.

Sebelum melakukan tes penghambatan hemaglutinasi, serum diolah terlebih dahulu

untuk menghilangkan zat non spesifik inhibitor. Adapun pengolahan serum untuk
penghambatan hemaglutinasi terhadap virus influenza adalah sbb :

Pengolahan serum untuk tes HI Virus Influenza.

- Masukkan 0,2 mL serum ke dalam tabung.

- Tambah 0,1 mL tripsin 0,25%
- Simpan pada penangas air 56oC selama 30 menit.
- Tambah 0,3 KIO3 (50 mg KIO3 dalam 20 mL aquadest panas).
- Simpan pada temperatur kamar selama 15 menit.
- Tambah 0,3 mL glyserin NaCl 1%.
- Simpan pada temperatur kamar selama 15 menit.
- Tambah 1,1 mL NaCl 0,85%, sehingga didapat cairan serum dengan konsentrasi
1/10.
- Buat pengenceran serum masing – masing 2 kali lipat dengan NaCl 0,85% (1/10,
1/20, 1/40,........dst).
- Tambahkan antigen 4 U HA pada tiap tabung sebanyak 0,2 mL yang dibuat dari
antigen yang kekuatannya 1 U HA.
Contoh : titer antigen 1 U HA = 1/32, jadi titer antigen 4 U HA adalah 1/8.
Pembuatannya : 1 bagian antigen stock + 7 bagian NaCl 0,85%.
- Kocok.
- Diamkan pada suhu kamar selama 1 jam.
- Tambahkan eritrosit ayam sebanyak 0,4 mL pada tiap – tiap tabung.
- Lakukan pula untuk kontrol.
Kontrol serum : Pada sebuah tabung isi dengan 0,2 mL serum 1/10 + 0,2 mL
NaCl 0,85% + 0,4 mL eritrosit ayam 0,5%.

25
 Kontrol eritrosit : Isi tabung dengan 0,4 mL NaCl 0,85 % dan eritrosit ayam
0,5%.
Kontrol antigen : Buat pengenceran antigen 2 kali lipat dari antigen 4 U HA
dengan NaCl 0,85% (4 U HA, 2 U HA, 1 U HA, 0,5 U HA),
masukkan masing – masing sebanyak 0,2 mL. Tambah 0,2
mL NaCl 0,85% pada tiap tabung, tambah eritrosit ayam 0,5%
sebanyak 0,4 mL.
Pengamatan :

Setelah didiamkan selama 1 jam, baca pada pengenceran berapa terjadi

penghambatan hemaglutinasi secara total dari serum I dan serum II. Tentukan
kenaikkan titer serum II terhadap serum I. Apabila kenaikan titer serum II terhadap serum
I sama atau lebih besar dari 4 kali, maka serum tersebut mengandung zat anti virus
influenza. Berarti penderita tersebut oleh virus influenza.

Contoh pembacaan :
Kontrol eritrosit
Kontrol serum I, II
Kontrol antigen
Pembacaan serum I
: negative (-)
: negative (-)
: negative (-) atau ± pada pengenceran 0,5 UHA
: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320

- - + + + +

Pembacaan serum II : 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320

- - - - - +

Jadi titer serum I : 1/20

Titer serum II : 1/160

Kenaikan titer serum II terhadap serum I = 8 kali (>4 kali)

Kesimpulan : Serum tersebut mengandung zat anti terhadap virus influenza. Dengan
kata lain influenza positif.

Catatan:

26
- Titer 1 U HA atau titer antigen adalah pengenceran antigen tertinggi yang masih
mampu menyebabkan hemaglutinasi secara total.
- Titer 4 U HA antigen adalah pengenceran antigen 4 kali lebih pekat dari cairan
antigen yang menyebabkan hemaglutinasi secara total.
- Titer serum adalah pengenceran serum tertinggi yang masih mampu menghambat
terjadinya hemaglutinasi secara total.
b. Tes Presipitasi

Tes ini berguna untuk mencari adanya antigen presipitin yang ada dalam bahan
pemeriksaan.

Prinsip : Antigen dengan anti serum akan terjadi perembesan ke dalam

agar yang berkonsentrasi rendah yaitu 1-2 %.Agar yang
berkonsentrasi rendah ini disebut gel, sehingga tes ini disebut
Immuno Gel Difusi Tes.

Contoh pemeriksaan : Menentukan adanya antigen vaccinia di dalam bahan

pemeriksaan.

Bahan yang diperlukan : - Agar dengan konsentrasi 1-2%

- Zat anti positif (anti serum vaccinia).

- Zat anti negatif (serum kelinci normal).
- Antigen positif (virus vaccinia).
- Antigen X (bahan pemeriksaan).

Alat – alat : - Gelas sediaan.

- Template plastik
- Karet pengikat
- Cawan petri
- Pipet pasteur

Cara Kerja :- Ambil dua buah gelas sediaan.

- Letakkan potongan dari gelas sediaan di atas gelas

sediaan tadi.

27
 - Gelas sediaan lain ditutupkan pada gelas sediaan
pertama.
- Ikat dengan karet.

- Letakkan di atas meja, kemudian dengan pipet paster

steril isap agar 1-2 % yang sedang dipanaskan.
- Masukkan diantara kedua lapisan ges tadi. (jangan
sampai ada gelembung udara dan agarnya jangan
mengalir keluar)
- Biarkan membeku pada suhu kamar.
- Setelah membeku kedua karet pengikat dilepas.
- Geserkan gelas sediaan yang paling atas kemana saja
arahnya.
- Tempatkan di atas agar tadi sebuah template plastik yaitu
gelas sediaan yang terbuat dari plastik yang sudah
mempunyai lubang dalam berbagai kedudukan.
- Dengan suatu alat tertentu dari lubang yang ukuranya
sama, seperti ukuran lubang template, masukkan alat
tersebut melalui lubang template sampai menembus agar.
- Template diangkat jangan sampai agarnya terbawa atau
pecah.
- Dengan jarum suntik keluarkan putarkan potongan agar
tadi.
- Teteskan pada lubang tersebut komponen –
komponennya.
- Pada lubang 1  zat anti positif.
2  antigen x.
3  zat anti negatif.
4  antigen positif.

28
 - Masukkan gelas sediaan tadi pada cawan petri yang di isi
dengan kertas saring basah.
- Cawan ditutup.
- Biarkan selama 24 jam pada suhu kamar.

Pembacaan :Setelah didiamkan selama 24 jam, baca ada tidaknya garis – garis
presipitasi.

Hasil positif (+) :

Hasil (±) :

Hasil negatif (-) :

c. Tes Netralisasi
Tes netralisasi ini berguna untuk :
1). Menentukan titer zat anti netralisasi.
2). Menentukan tipe virus yang berasal diisolasi.

Contoh pemeriksaan virus polio.

- Titrasi virus pada biakan jaringan.
- Identifikasi virus yang baru diisolasi dalam biakan jaringan dengan tes netralisasi.

Cara titrasi virus pada biakan jaringan.

Prinsip : Virus bila di tanam pada biakan jaringan akan menimbulkan cpe
(cytopathogenic effect). Dicari pengenceran virus tertinggi yang
menyebabkan cpe 50% atau setengahnya dari biakan jaringan yang
ditanami virus yang disebut 1 TCD50 (tissue culture dose).

29
Bahan : - Biakan Jaringan ginjal kera

- Larutan Hank’s
- Suspensi Virus

Alat : - Mat pipet

- Rak tabung
- Mikroskop

Cara Kerja : - Sediakan tabung – tabung biakan jaringan.

- Periksa pertumbuhan selnya dengan mikroskop.

- Cuci jaringan dengan larutan Hank’s.
- Isi tiap tabung dengan 1-2 mL mediumnya (mis. Earle’s medium).
- Buat cairan – cairan dari suspensi dari suspensi virus sbb :
10-1 10-2 10-3 10-4… dst, dengan buffer phosfat-NaCl 0,85% pH 7,2
atau larutan Hank’s.
- Tanam tiap – tiap cairan pada 4 tabung masing – masing 0,1 mL.
- Eramkan pada suhu 37oC selama 7-14 hari.
Sediakan 4 tabung kontrol yang tidak ditanami virus, dan eramkan juga
bersama- sama.
- Setelah dieramkan, periksa ada tidaknya cpe.
- Hitung berapa 1 TDC50.

Pembacaan :

Pembacan tes netralisasi ini dilihat ada tidaknya cpe, yaitu sel yang mula – mula
berbentuk kumparan, kemudian berubah menjadi bulat berkelompok. Inti menjadi besar,
struktur inti menjadi kasar dan sebagian inti kelihatan lebih gelap.

Cari nilai 1 TCD50 yaitu pengenceran virus tertinggi yang masih menyebabkan cpe 50%
pada tabung yang ditanami virus. Maka untuk mencari nilai 1 TDC50 nya dihitung dengan
cara Reed dan Muench.

30
Perhitungan Reed dan Muench:

Hasil pembacaan:

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

++++ ++++ ++++ ++++ +++- +--- - ---

Jumlah
Pengenceran cpe (+) cpe (-) Persen (%)
Cpe (+) Cpe (-)
10-1 4 0 20 0 100 %
10-2 4 0 16 0 100 %
10-3 4 0 12 0 100 %
10-4 4 0 8 0 100 %
10-5 3 1 4 1 80 %
10-6 1 3 1 4 20 %
10-7 0 4 0 8 0%

80-50

1 TCD50 = 10-5 + 10-80-20

= 10-5 + 10-0,5

= 10-5,5

Cara identifikasi virus yang baru di isolasi dalam biakan jaringan dengan tes netralisasi.

Prinsip : Mencampur antigen dan anti serum dengan kekuatan tertentu dalam
volume yang sama banyak. Dilihat daya anti serum untuk menetralisasi daya infeksi
virusnya.

Bahan : - Biakan jaringan ginjal kera

- Larutan Hank’s
- Anti serum spesifik.

Alat : - Mat pipet

- Rak tabung
- Mikroskop

31
Cara Kerja :

- Sediakan tabung – tabung biakan jaringan

- Cuci dengan larutan Hank’s, berikan mediumnya.
- Serum spesifik di inaktifasi pada suhu 56oC selama 30 menit.
- Buat pengenceran serum dengan larutan Hank’s (10-1 10-2 ...dst)
- Encerkan virus yang baru di isolasi hingga mengandung 100 TCD50 dengan
larutan Hank’s.
- Campur sama banyak serum dengan antigen.
- Eramkan campuran virus dan serum pada suhu 4oC selama 1 malam atau pada
suhu kamar selama 1 jam.
- Tanam tiap campuran virus-serum ke dalam 4 buah tabung biakan jaringan
masing – masing 0,2 mL.
- Eram semua tabung pada suhu 37oC selama 1-2 minggu.
- Periksa terjadinya cpe.

Pengamatan :

Bila cpe oleh virus yang baru diisolasi tidak dapat dicegah oleh serum yang
digunakan, maka virusnya harus dites lagi terhadap serum yang lainnya.

Bila cpe yang ditimbulkan oleh virus yang baru di isolasi dapat dicegah oleh serum
spesifik (anti serum polio), maka virus tersebut adalah virus polio.

d.Fluorescensi Antibodi Test (FAT)

Cara Fluorescensi Antibodi Test tidak memerlukan bahan dalam jumlah yang banyak
dan banyak dikatakan cara ini sensitive sekali.

Prinsip : Mereaksikan virus (antigen) dengan suatu antibodi yang telah dilabel atau
dikonjugasi terlebih dahulu dengan suatu zat flourencensi (misalnya
fluorenscein Isothiocyanate).

Ada dua cara pemeriksaan FAT yaitu :

- Cara Langsung
- Cara Tidak Langsung

32
1). Cara Direct.

Pada cara direct, antiserum spesifik (antibodi) dilabel dengan zat fluorescen
Isothiocyanate dan digunakan untuk identifikasi adanya antigen.

Contoh : otak yang tersangka rabies ditambah konjugat kemudian dilihat di

bawahmikroskop.

2). Cara Indirect.

Pada cara indirect, antiserum spesifik (antibodi) yang tidak dilabel dicampur dengan
virus (antigen) supaya terbentuk ikatan antigen antibodi. Kemudian direaksikan dengan
antibodi yang dilabel (anti human globulin), sehingga akan terbentuk fluorescensi hijau
(FAT positif).

Contoh : jaringan otak anjing (antigen) ditambah antibodi yang tidak dilabel (anti
human globulin)  terjadi ikatan antigen – antibodi. Ikatan antigen –
antibodi tersebut direaksikan dengan antibodi yang dilabel (anti human
globulin)  terbentuk fluorescensi hijau ( Rabies positif).

e. ELISA

Pemeriksaan ELISA dapat dipakai untuk :

1. Mencari antigen dalam bahan pemeriksaan.

2. Mencari antibodi dalam bahan pemeriksaan.

Prinsip : Penambahan enzym tertentu akan menyebabkan hidrolisis dan derajat

hidrolisis enzim ini sebanding dengan ada/ tidaknya atau banyak sedikitnya
antigen/antibodi yang sedang dicari.

Cara kerja :

- Pipet 10ul kontrol dan spesimen kedalam tray (2 negatif dan 3 positif ).
- Tambahkan 400 ul pengencer spesimen ke masing – masing kontrol dan
spesimen.
- Tambahkan bead ke dalam lubang yang berisi kontrol dan spesimen masing –
masing 1 buah.

33
- Ketuk – ketukan tray agar spesimen melekat dengan baik pada bead dan juga
untuk menghilangkan gelembung udara.
- Tutup tray dengan cover seal.
- Inkubasi 40ᴼC selama 30 menit.
- Buka cover seal lalu cuci bead 2-3 kali.
- Tambahkan 200 mL konjugat yang sudah diencerkan.
- Ketuk – ketukan tray untuk menghilangkan gelembung udara kemudian tutup
tray dengan cover seal yang baru.
- Inkubasi 40oC selama 30 menit.
- Cuci bead 2-3 hari.
- 10 menit sebelum inkubasi kedua selesai, siapkan larutan OPD berdasarkan
perbandingan 1 tablet berbanding 5 mL larutan.
- Pindahkan bead ke dalam tabung reaksi.
- Pipet 300 µl larutan OPD (substrat) ke dalam 2 tabung reaksi yang kosong
(blanko) dan juga ke dalam masing – masing tabung yang berisi bead.
- Tutup dengan plastik hitam dan inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.
- Tambahkan 1 mL asam sulfat 1N ke dalam masing – masing tabung untuk
menghentikan reaksi.
- Campur sampai homogen.
- Baca pada spectrophotometer.

34
LAMPIRAN

Pembuatan Larutan Hank’s :

a. Larutan stock Hank’s I :
- Timbang : - NaCl 80 gram
- MgCl2.6H2O 1 gram
-MgSO4.7H2O 1 gram

- Larutkan dengan aquadest hingga 1 liter.

- Sterilkan pada suhu 120oC selama 30 menit.

b. Larutan stock Hank’s II :

- Timbang : - Na2HPO4.12H2O 80 gram
- KH2PO4 1 gram
- Larutkan dalam 960 mL aquadest

- Kocok

- Sterilkan pada suhu 120oC selama 30 menit.

Pembuatan Larutan Hank’s ( Hank’s oplos)

- Sediakan botol 1 liter yang berisi 960 mL aquadest.
- Masukkan kedalamnya masing – masing 100 mL stock Hank’s I dan 100 mL stock
Hank’s II.
- Tambahkan 10 mL glukosa 10%.
- Tambahkan 4 mL Sodium Bicarbonat 8,8%.
- Tambahkan pula aquadest steril hingga 1 liter.
- Bubuhi penstrep hingga 200 U/mL.
Pembuatan larutan Earle’s :
a. Larutan Earle’s I :
- Timbang : - NaCl 68 gram

- KCl 4 gram

- CaCl2 2 gram

35
 - MgSO4.7H2O 2 gram

- Larutkan dengan aquadest hingga 1 liter.

- Bagi menjadi 10 botol masing – masing 100 mL.
- Sterilisasi pada suhu 120oC selama 30 menit dalam autoclave.
- Simpan dalam lemari es.

a. Larutan Earle’s II :
- Timbang NaH2PO4.H2O 1,4 gram
- Larutkan dalam aquadest hingga 1 liter
- Bagi menjadi 10 botol masing – masing 100 mL.
- Sterilisasi pada 120oC selama 30 menit dalam autoclave.
- Simpan dalam lemari es.

b. Pembuatan Earle’s Medium

- Masukkan 560 mL aquadest steril ke dalam botol 1 liter.

- Tambahkan : - 100 mL Larutan Earle’s I
- 100 mL Larutan Earle’s II
- 10 mL Larutan Glukosa 10%.
- 100 mL Larutan Laktalbumin 5%.
- Kocok
- Tambah aquadest steril hingga 1000 mL.
- Tambah serum kuda 20 mL.
- Tambah larutan penstrep 20.000 Unit/mL sebanyak 12,5 mL.
- Tambah Natrium Bicarbonat 8,8% sebanyak 25 mL.
- Tambah Phenol Red 0,5% sebanyak 4 mL.
- Tambah 1 mL larutan MgCl2 2,5 M (untuk golongan enterovirus).

36
 PEMERIKSAAN IgG / IgM DENGUE

DEMAM BERDARAH DENGUE

Penyakit demam berdarah dengue disebabkan oleh virus dengue yang termasuk
dalam virus arbo. Manifestasi klinik dari penyakit ini amat bervariasi, mulai dari penyakit
yang paling ringan, demam dengue(DF), demam berdarah dengue (DHF). Dan dengue
shock syndrome (DSS), virus dengue terdiri dari 4 serotipe yaitu DEN-1, DEN-2, DEN-3,
dan DEN-4. Struktur antigen dari ke-4 serotipe ini sangat mirip satu dengan yang lain,
namun antibody terhadap masing-masing serotype tidak dapat saling memberikan
perlindungan silang.

Di dalam tubuh manusia virus berkembang biak dalam system retikuloendotelial,

dengan target utama virus dengue adalah monosit atau makrofag walaupun sel-sel lain
seperti sel kupfer dari hepar juga dapat terkena. Viremia timbul terjadi reaksi anamnestik
dari pembentukan antibody, khususnya daripada saat menjelang tampak gejala klinik
hingga 5-7 hari sesudahnya.Virus bersirkulasi dalam darah perifer di dalam sel
monosit/makrofag, sel limposit B dan sel limposit T.

Infeksi primer ditandai dengan timbulnya antibody IgM terhadap dengue sekitar 3-
5 hari setelah timbulnya demam, menngkat tajam dalam satu sampai tiga minggu,
bertahan selama 30-90 hari, meskipun pada bebrapa kasus ada yang masih dapat
dideteksi hingga delapan bulan. Antibodi IgG terhadap dengue diproduksi sekitar dua
minggu sesudah infeksi.Titer IgG ini meningkat amat cepat, lalu menurun secara lambat
dalam waktu yang lama dan biasanya bertahan seumur hidup. Pada infeksi sekunder
kelas IgG dimana pada hari kedua saja, IgG ini sudah dapat meningkat tajam kemudian
akan diikuti dengan timbulnya IgM anti-dengue.

Terdapat korelasi antara infeksi dengue primer-sekunder dengan beratnya

penyakit.Beberapa literatur menunjukkan bahwa, infeksi primer hanya menyebabkan
suatu keadaan yang disebut ‘febrile self limiting disease’ sedangkan infeksi sekunder
dapat menimbulkan komplikasi yang berat.

Pemeriksaan antibody IgG dan IgM yang spesifik berguna dalam diagnosis infeksi virus
dengue.Kedua antibody ini muncul 5 – 7 hari setelah infeksi.Hasil negative bisa saja
muncul mungkin karena pemeriksaan dilakukan pada awal terjadinya infeksi.IgM tidak

37
terdeteksi 30 – 90 hari setelah infeksi, sedangkan IgG dapat tetap terdeteksi seumur
hidup.IgM yang positif memiliki nilai diagnostic bila disertai dengan gejala yang
mendukung terjadinya demam berdarah.Pemeriksaan IgG dan IgM ini juga bisa
digunakan untuk membedakan infeksi dengue primer dan sekunder.

Tujuan : Menentukan Antibodi IgG dan IgM terhadap Virus Dengue

Prinsip :

Apabila tedapat antibody dengue baik IgM atau IgG didalam serum akan diikat
oleh anti-human IgM atau IgG yang dilapiskan pada dua garis silang distrip nitroselulosa.
Kemudian formasi ikatan konjugat antibody monoclonal berlabel dan koktail antigen
rekombinan dengue 1,2,3,4 yang juga ada dinitroselulose, ditangkap (captured) oleh
ikatan serum antibody dengue spesifik IgM atau IgG dengan anti-human pada garis
silang dan membentuk garis berwarna pink/ungu.

Bahan : serum atau plasma

Alat

 Card test / test strip

 Pipet
 Diluent sampel
 Kontrol positif dan negatif
 Stabilitas penyimpanan test srtip
 Simpan pada suhu 2 - 30ᴼC
 Tidak tekena sinar matahari langsung.

Warning and Precautions

1. Semua hasil positif harus dikonfirmasi ke metode alternatif

2. Semua specimen yang diperiksa berpotensi infeksius. Gunakan sarung tangan
dan pakaian pelindung ketika menangani sampel.
3. Perangkat yang digunakan untukpengujian harusdiautoklafsebelum dibuang.
4. Jangan menggunakan bahan kit setelah tanggal kadarluarsa
5. Bahan Whole Blood harus digunakan segera setelah pengumpulan.

38
Pengumpulan sampel dan penyimpanan

Whole Blood :

Kumpulkanspesimendarahlengkap (Whole Bllod )mengikutiProsedur dasarlaboratorium

klinisbiasa

Cara Kerja :

1. Siapkan test dan buffer pada temperatr kamar

2. buka test card dan simpan pada permukaan meja yang bersih, dan beri identitas
3. teteskan buffer 4 tetes pada tabung, tambahkan sampel 1 loop( 1 µl),
homogenkan
4. pindahkan serum yang diencerkan ke test card, baca setelah 15-30 menit.
5. Jangan dibaca lebih dari 60 menit.

INTERPRETASI HASIL

39