PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROTEKNIK HEWAN

Oleh

WA ODE HARLIS

LABORATORIUM BIOLOGI FMIPA

UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2021

1
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR i
DAFTAR ISI ii
1. PERATURAN/ TATA TERTIB 3
2. Latihan I 4
PREPARAT APUS

3. Latihan II 6
PREPARAT RENTANG

4. Latihan III 8
METODE PARAFIN

5. Latihan IV 5
"WHOLE MOUNT" EMBRIO AYAM

6. Latihan V 6
PEWARNAAN SUPRAVITAL

PUSTAKA 7

2
 PERATURAN/ TATA TERTIB

1. Setiap praktikan/ mahasiswa yang melakukan praktikum

Mikroteknik Hewan wajib menjaga kebersihan dan ketertiban
laboratorium, sebagai berikut :
a. Cairan- cairan yang beracun jangan sampai berceceran,
sebab bisa membahayakan jiwa sendiri atau kawan-kawan
se-laboratorium.
b. Bilamana menggunakan bahan-bahan kimia yang mudah
terbakar/ meledak supaya ingat bahaya dan berhati-hati.
Dilarang keras merokok didekat bahan-bahan kimia yang
mudah terbakar.
c. Setiap kali menggunakan alat-alat yang harus dicuci,
segeralah dicuci. Misalnya alat-alat gelas (pipet-pipet tetes,
petridish, gelas-gelas pengukur, gelas-gelas arloji, tabung-
tabung reaksi dsb., pinset, skapel dsb.

2. Bilamana seseorang praktikan merusakkan/ menghilangkan

sesuatu alat/buku milik laboratorium, haruslah melaporkannya dan
mengganti kerusakan atau kehilangan tersebut
3. Setiap praktikan harus mencatat apa saja yang sedang/akan/sudah
dikerjakan dan membuat laporan praktikum pada buku kerja yang
disediakan.
4. Setiap praktikan akan di"tes" baik sebelumnya, sesudahnya
maupun selama praktikum berlangsung. Ujian hanya
diperuntukkan bagi mereka yang telah selesai menjalankan
praktikum dan telah mengikuti ujian praktikum.
5. Semua peraturan-peraturan yang belum tercantum disini dapat
ditambahkan bila perlu.

3
Setiap pelanggaran atas tata tertib akan dikenakan tindakan
disiplin.

4
 Latihan I
PRAPARAT APUS
(“Smear Preparation”)
A. Apusan Darah

Bahan dan alat:

1.darah tepi dari manusia/ hewan
2. kaca benda bersih bebas lemak
3. jarum Frankle atau lanset steril
4. alkohol 70%
5. bejana dan rak
6. pipet tetes
7. kertas isap
8. larutan pewarna
Giemsa 3%
9. aquadest suhu 37o C
Cara Kerja :

Dengan metode Giemsa

1. Film darah kering difiksasi dengan alkohol absolut selama

30 menit.
2. Keringkan di udara,
3. Film darah ditetesi dengan larutan Giemsa 3% biarkan
selama 30-50 menit.
4. Cairan dibuang, film dicuci dengan aquadest mengalir
5. Keringkan di udara.

5
Pengamatan : 1. Digunakan mikroskop cahaya obyektif-okuler 10X10,
20X10, 40X10, dan 100X 10 yang sebelumnya film
darah sudah ditetesi dengan minyak imersi.
2. Buatlah matriks, yang berisi komponen darah (korpuskula
darah) dengan warna bagian-bagian sel yang sesuai
dengan metode pewarnaan.

B. Apusan Sperma

Pengamatan morfologi spermatozoa dilakukan dengan cara satu tetes

suspensi spermatozoa diteteskan di atas kaca preparat kemudian dibuat
sediaan apus dan dikering udarakan. Selanjutnya difiksasi dengan etanol
selama 5 menit kemudian dikeringkan dan ditambahkan pewarna giemsa
20% selama 10 menit dan dibilas dengan aquades lalu dikering udarakan.
Pengamatan sediaan dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan
perbesaran 400x

C. APUSAN VAGINA

Pemeriksaan apusan vagina dengan cara memasukkan Cotton bund pada

vagina mencit yang telah dicelupkan aquades suhu 37o C, selanjutnya
digoreskan pada kaca objek. Selanjutnya difiksasi dengan etanol selama 5
menit kemudian dikeringkan dan ditambahkan pewarna giemsa 20%
selama 10 menit dan dibilas dengan aquades lalu dikering udarakan.
Pengamatan sediaan dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan
perbesaran 400x

D. PARASIT MALARIA
Diteteskan beberapa tetes darah pada kaca preparat bersih (sebanyak 0,1
– 0,2 ml) pada jarak sekitar 2-3 cm dari salah satu ujung kaca preparat..

6
darah disebarkan dengan bantuan jarum kecil Selanjutnya difiksasi
dengan etanol selama 5 menit kemudian dikeringkan dan ditambahkan
pewarna giemsa 20% selama 10 menit dan dibilas dengan aquades lalu
dikering udarakan. Pengamatan sediaan dilakukan di bawah mikroskop
cahaya dengan perbesaran 400x

7
 Latihan II
PRAPARAT RENTANG
("Spread preparation")

Tujuan : Membuat sediaan mikroskopi dari jaringan ikat longgar

(dikerjakan kalau ada pembedahan).

Bahan dan alat : 1. jaringan ikat subkutis (jaringan pengikat longgar atau
jaringan yang mengandung sel-sel lemak),
mesentrium,
pericardium dll.
2. kaca benda bersih bebas lemak
3. kaca penutup
4. jarum preparat
5. Canada balsam
6. larutan pewarnaan Hematoksilin- Eosin
7. Pinset, skalpel
Cara Kerja :
1. Dengan pinset halus diambil jaringan subkutis yang masih segar,
lalu digunting.
2. Rentangkan jaringan tersebut di atas kaca benda.
3. Keringkan di udara.

Pewarnaan :

Metode Hamatoksilin-Eosin

1. Masukkan kaca benda dalam larutan Ehrlich Hematoksilin selama 20

hitungan.
2. Cuci dengan air mengalir selama 10 menit.

8
3. Dehidrasi dengan cara memasukkan kaca benda tersebut ke dalam
 Alkohol 30% selama 1 menit
 Alkohol 40% selama 1 menit
 Alkohol 50% selama 1 menit
 Alkohol 60% selama 1 menit
 Alkohol 70% selama 1 menit
4. Kaca benda dimasukkan ke dalam arutan Eosin-Y selama 2 menit.
5. Cuci dengan alkohol 70% sampai bersih.
6. Kaca benda dimasukkan ke dalam
 Alkohol 80% selama 1 menit
 Alkohol 90% selama 1 menit
 Alkohol 96% selama 1 menit
 Alkohol absolut selama 1 menit
7. Kaca benda dimasukkan ke dalam

 Alkohol absolut : Xilol (1:1) selama 5 menit.

 Xilol I selama 5 menit
 Xilol II selama 5 menit
 Xilol III selama 5 menit
8. Mounting dengan Canada balsam.
9. Keringkan di atas “hot plate”.
10. Pengamatan dan gambar komponen penyusun jaringan ikat longgar.

9
 Latihan III
METODE PARAFIN

Tujuan : Mempelajari komponen penyusun jaringan atau organ

yang disayat setebal 6 – 10 mikron.

Bahan dan Alat : 1. organ dari hewan (testis dan Ovarium)

2. larutan kloroform
3. larutan fiksatif
4. alkohol
5. xilol
6. toluol
7. paraffin cair
8. larutan pewarna HE
9. Canada balsam
10. kapas
11. kaca benda
12. kaca penutup
13. pinset
14. skalpel
15. jarum preparat
16. gunting
17. silet
18. flakon
19.mikrotom & pisau

Cara Kerja :
1. Hewan di “narkose” dengan kloroform.
2. Dibuka rongga perutnya (“sectio”)

10
a. Fiksasi
Ambil organ, cuci dengan larutan garam fisiologis (NaCl 0,9 %),
masukkan ke dalam botol ampul yang berisi larutan fiksatif Bouin
selama 48 jam dan diberi label
b. washing, dehidrasi dan clearing
1. organ dicuci dengan alcohol 70% 1 jam
` 2.dehidrasi dengan alkool 70% 1 jam, 80% 1 jam, 90% semalam
3. masukkan dalam alcohol 96% 1 jam, alcohol absolut 1 jam
4. untuk menjernihkan organ direndam dalam toluol selama semalam
c. Infiltrasi dan embedding
1. infiltrasi paraffin kedalam jaringan diakukan dengan cara merendam
organ ke dalam campuran toluol dan paraffin dengan perbandingn 1 : 1
selama 30 menit
2. masukkan dalam paraffin I, II, dan III masing-masing 45 menit
Embedding yaitu penanaman organ dalam paraffin cair diatur sehingga
arah pemotongan meintang, kemudian dibiarkan membeku dalam
refrigerator dan membentuk blok yang mudah diiris dengan mikrotom
d. Pengirisan dan penempelan
Blok paraffin yang mengandung potongan organ diletakkan pada holder
dengan paraffin cair agar melekat ert dan selanjutnya dimasukkan
kedalam refrigerator.
Holder dengan blok paraffin keudian dipasang pada mikrotom, selanjutnya
diiris setebal 6 mikrometer, seingga deretan irisan membentuk pita.
Irisan-irisan tersebut dipilih yang bagus kemudian ditempel pada kaca
objek yang tela diolesi mayer’s albumin dan aquadest.
Dibiarkan 24 jam agar penempelan cukup kuat
e. Staining dan mounting
1. deparafinisasi. Gelas benda yang berisi irisan organ dicelupkan
kedalam xilol sampai paraffin larut semua 15 menit kemudian
dikeringkan diatas kertas saring

11
2. hidrasi, gelas benda yang sudah dikeringkan tadi dimasukkan ke dalam
alcohol dengan konsentrasi menurun mulai dari alcohol absolute 96%,
90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% dan aquadest masing masing 1
menit
3. dimasukkan ke dalam staining jar yang berisi Hematoxylin Ehrlich (7
detik) dicuci dengan air mengalir 10 menit
4 dimasukkan ke dalam alcohol 30, 50%, 60% dan 70% masing-masing
selama 1 menit.
5 dimasukkan ke dalam Eosin-Y selama 2 menit kemudian dibilas dengan
alcohol 70%, 80%, 90%,96% dan alcohol absolute masing-masing
selama 1 menit
6.dimasukkan ke dalam xilol 15 menit kemudian dikeringkan diatas kertas
saring
7. dimounting dengan Canada balsam ditutup dengan kaca penutup dan
dikeringkan diatas slide warmer suhu 42oC selama 2 hari
8. dilakukan pengamatan dibawah mikroskop perbesaran 100X

12
 Latihan IV

"WHOLE MOUNT" EMBRIO AYAM

Tujuan : Membuat preparat utuh dari embrio ayam.

Bahan dan Alat : 1. gunting biasa

2. gunting kecil bengkok (khusus untuk
menggunting bagian ekstra embrional)
3. pinset kecil ujung runcing lurus
4. pinset kecil ujung runcing bengkok
5. gelas arloji besar
6. gelas arloji kecil
7. bejana untuk tempat larutan garam fisiologis
panas (hangat) untuk membakar telur.
8. larutan garam fisiologis (NaCl 0,9%) dengan suhu
± 40oC
9. pipet
10. kertas filter
11. larutan fiksatif

Cara Kerja :

1. Menginkubasi telur berembrio dalam inkubator yang sudah diatur

suhunya (39oC-40oC). Lama inkubasi antara 33-48 jam.
2. Dengan teropong tertentu, buatlah lingkaran dengan pensil tempat
embrio yang akan dibuka. Masukkan telur ini ke dalam sebuah bejana

13
 yang berisi larut garam fisiologis tersebut diatas, diusahakan supaya
telur itu tenggelam seluruhnya.
3. Bagian yang tumpul (rongga udara) ditusuk, sehingga keluar
gelembung-gelembung udara, sehingga vitelus turun yang akan
memudahkan membuka kulit telur, apabila vitelus pecah garam
fisiologis menjadi keruh sehingga embrio sukar ditemukan.
4. Dengan pinset tusuklah sehingga berlubang kulit kapur yang telah
ditandai dengan pensil tadi, dengan gunting bengkok lingkaran pada
kulit kapur digunting, apabila sudah tergunting semuanya, kulit kapur
diangkat dengan pinset, maka embrio akan tampak.
5. Guntinglah membran vitelina, selanjutnya menggunting dengan gunting
kucil bengkok area embrional diluar sinus terminalis, juga dibawah
blastoderm digunting supaya lepas dari vitelus. Dengan hati-hati
tariklah blastoderm tersebut dengan pinset dan diambil dengan gelas
arloji kecil untuk kemudian dipindahkan ke dalam gelas arloji besar dan
cucilah blastoderm itu dengan larutan garam fisiologis hangat sampai
bersih dengan semprotan-semprotan pipet perlahan-lahan.
6. Isaplah cairan disekitar blastoderm yang telah rata dan menempel
pada gelas arloji itu, usahakanlah agar blastoderm dan daerah ekstra
embrional tidak melipat.
7. Ambil kertas saring yang telah dibentuk yang lebih besar daripada
lingkaran embrio tadi, tengahnya diberi lubang cukup untuk embrio,
letakkan sedemikian rupa sehingga embrio di tengah lubang dan tidak
terjadi lipatan pada area ekstra embrional. Hindari adanya gelembung
udara pada perlekatan antara kertas saring dengan daerah ekstra
embrional. Perlekatan antara blastoderm dengan
kertas saring harus erat, ini untuk menghindari lepasnya blastoderm
pada proses selanjutnya.
8. Selanjutnya difiksasi (larutan Bouin) dengan pipet tetes, tetesilah
dengan hati-hati, semprotkan sedemikian rupa sehingga akhirnya
blastoderm tidak melekat pada gelas arloji, tunggu beberapa saat (10

14
 menit), jepitlah kertas saring tersebut dengan pinset untuk selanjutnya
direndam dalam larutan fiksatif pada tempat yang lebih besar (cawan
petri bertutup), dalam larutan fiksasi minimal
40 menit, tergantung pada besar kecilnya embrio.

Pewarnaan :

Dilakukan dengan pewarnaan tunggal

A. Larutan Ehrlich Hematoksilin atau
B. Larutan Eosin-Y

A. Larutan Ehrlich Hematoksilin (semua langkah dikerjakan di dalam

cawan
Petri bertutup)
1.Washing
Dari larutan Bouin jepitlah dengan pinset kertas saring yang telah ada
blastodermnya, masukkan dalam cawan petri yang berisi alkohol 70%
selama15 menit (diganti 3X5 menit).
2. Hidrasi : dengan cara yang sama pindahkan embrio dalam :
Alkohol 60% selama 5 menit
Alkohol 50% selama 5 menit
Alkohol 40% selama 5 menit
Alkohol 30% selama 5 menit
Air suling selama 5 menit
3. Pewarnaan :
Dengan cara yang sama embrio dimasukkan dalam larutan
Hematoksilin selama “20 hitungan” selanjutnya dilakukan
4. Washing:
Embrio ditempatkan pada cawan Petri yang berisi air ledeng, tutup
dengan kain kasa yang diikat dengan karet gelang, masukkan ke
dalam bejana, bejana ini dialiri dengan air ledeng yang mengalir dari

15
 selang yang terbuat dari plastik dengan diameter kurang dari 1 cm,
biarkan 10 menit.
5. Dehidrasi : pindahkan embrio dalam
Air suling selama 5 menit
Alkohol 30% selama 5 menit
Alkohol 40% selama 5 menit
Alkohol 50% selama 5 menit
Alkohol 60% selama 5 menit
Alkohol 70% selama 5 menit
Alkohol 80% selama 5 menit
Alkohol 90% selama 5 menit
Alkohol 96% selama 5 menit
Alkohol absolut selama 5 menit

6. Dealkoholisasi (Clearing)
Masukkan embrio ke dalam cawan petri bertutup berisi toluol biarkan
di sini sampai dengan somit dan bagian kepala terlihat jelas di bawah
mikroskop cahaya. Selanjutnya untuk menghilangkan toluol, embrio
dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi xilol, biarkan disini
selama 15 menit.
7. Mounting :
 Siapkan kaca benda yang sudah diberi 1-2 tetes Canada balsam.
 Ambil kertas saring yang ada embrionya dari xilol.
 Letakkan embriopada kaca benda yang telah diberi Canada
balsam, hindari gelembung udara di bawah embrio. Dengan
skalpel atau silet lepaskan kertas saring dari bagian embrio yang
melekatnya, selanjutnya embrio diberi Canada Balsam
secukupnya, ditutup dengan kaca penutup dengan hati-hati untuk
menghindari adanya gelembung udara.
 Keringkan kaca benda tersebut di atas “hot plate”
8. Pengamatan :

16
  Dengan mikroskop cahaya amati atau hitung jumlah somit dan
usahakan untuk dapat mengidentifikasi bagian-bagian embrio
tersebut.
 Kalau embrio sudah besar, sehingga melebihi medan pandang
mikroskop, maka amatilah dengan mikroskop stereo dengan latar
belakang gelap dan cahaya lampu dari depan mikrosop.

B. Larutan Eosin-Y (pelarut alkohol 70%)

Dengan cara yang sama seperti pada A dari fiksatif Bouin dilakukan:
Washing : dalam alkohol 70% selama 15 menit (diganti 3X@ 5 menit)
Pewarnaan : dalam larutan pewarna Eosin Y selama 2 menit.
Washing : alkohol 70% selama 15 menit (diganti 3X @ 5 menit)
Dehidrasi:
 Alkohol 70% selama 5 menit
 Alkohol 80% selama 5 menit
 Alkohol 90% selama 5 menit
 Alkohol 96% selama 5 menit
 Alkohol absolut selama 5 menit

Dealkoholisasi (clearing): dalam toluol sampai somit dan bagian kepala

tampak jelas.
Mounting : langkah seperti prosedur pewarnaan A.
Pengamatan : sama dengan prosedur pewarnaan A.

17
 Latihan V
PEWARNAAN SUPRAVITAL

Tujuan : Mengamati bagian-bagian sel tanpa mematikan sel-sel

tersebut.

Bahan da Alat: 1. skalpel

2. kaca benda (3)
3. kaca penutup (3)
4. alkohol 70%
5. kapas
6. mikroskop cahaya
7. Larutan pewarna :
a. Janus green 0,05% dalam garam fisiologis atau air
suling
b. Neutral 0,05% dalam garam fisiologis atau air suling
c. Campuran larutan (a) dan (b) perbandingan 1:1

Cara kerja :

1. Bersihkan ujung skalpel yang tumpul dengan alkohol 70%.

2. Dengan ujung skalpel tersebut, keruklah selaput lendir mulut pada
bagian sebelah dalam pipi.
3. Teteskan selaput lendir mulut tersebut, di atas kaca benda yang bersih,
selanjutnya tetesi dengan larutan pewarna no.(a), kemudian ditutup
dengan kaca penutup (hindari adanya gelembung udara). Amati
dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran okuler-obyektif 10X10
kalau sudah jelas diganti dengan yang 10X40, amati sel-sel epitel pipih
yang tidak saling bertumpukan.

18
Hasil Pengamatan :

Gambarlah sel epitel pipih tersebut dengan memperhatikan warna inti,

sitoplasma dan apabila mungkin amati mitokondria yang biasanya terletak
disekitar inti sel.
1. Ulangi langkah no.1 sampai dengan no.3 tetapi pewarnaan yang
berbeda-beda.
2. Coba digambar dan dibandingkan penyerapan bagian-bagian sel
tersebut dengan 3 pewarnaan yang berbeda.

19
 LATIHAN VI
KROMOSOM PADA KELENJAR LUDAH
Drosophyla

Kelenjar ludah Drosophyla mempunyai jenis kromosom yang spesifik yaitu

bentuk kromosom yang sambung menyambung menyerupai pita yang
panjang. Kelenjar ludah tersebut ada pada bagian anterior larva yang
keluarkan dengan cara menarik bagian aterior dengan menggunakan dua
buah jarum diseksi pada arah yang berlawanan. Kelenjar ludah tadi
diletakkan pada kaca preparat yang telah dibubuhi larutan garam fisiologis
(Nacl 0,9 %). Pisahkan kelenjar ludah dari jaringan lemak yang ada.
pindahkan kelenjar ludah tersebut pada kaca preparat lain yang telah
ditetesi pewarna acetocarmin. Kaca penutup ditutupkan, gitekan-tekan
dengan ibu jari, lalu dilewakan diatas bunsen. Tekan-tekan kembali
dengan ibu jari hingga dinding sel pecah dan membebaskan kromosom.
Kromosom siap diamati dengan mikroskop perbesaran 100X.

20
 DAFTAR PUSTAKA

Gray, P. 1954. The Microtomist’s Formulary and Guide.The Blakiston

Company, Inc.., N.Y. Toronto

Mc. Aunus, J. F.A., and R.W. Mowry. 1960. Staining Methods : Histologic
and Histochemical Paul B. Hoeber Inc. Medical Divisionm of Harper
& Brother

Preece, A. 1959. A. Manual for Histologic Techncians. Little Brown and

Company, Boston, Toronto.

Soetjipta,. 1968. Diktat Petunjuk Praktikum Mikroteknik Hewan.Seksi

Anatomia Comparativa Fakultas Biologi UGM Yogyakarta.

21