A.

Metode Preparat Parafin Testis Mencit (Mus musculus)

Mencit yang telah diberi perlakuan dimatikan lalu dibedah dengan menggunakan alat
bedah, kemudian testisnya diambil. Pengawetan jaringan terdiri dari proses trimming, dehidrasi,
clearing, impregnasi (infiltrasi parafin), embedding (pengeblokan jaringan), cutting (pemotongan
jaringan), penempelan, dan pewarnaan. Untuk lebih jelasnya sebagai berikut :

1. Memfiksasi organ testis, dengan merendamnya di dalam larutan formalin 10 % selama 24

jam. Testis yang sudah difiksasi kemudian dicuci dengan air mengalir sebanyak dua kali
berturut-turut selama satu jam.

2. mendehidrasi organ testis, dengan cara merendam testis pada alkohol dengan konsentrasi 70
% selama dua jam, kemudian konsentrasi 80 % selama dua jam, lalu konsentrasi 95 % selama
dua jam. Kemudian alkohol 95 % satu jam dan alkohol absolut selama satu jam sebanyak tiga
kali berturut-turut.

3. Penjernihan testis, dengan cara merendam testis dengan xylol sampai transparan atau
tenggelam dalam xylol sebanyak tiga kali, selama satu jam berturut-turut.

4. Impregnasi, dimulai dengan pemanasan parafin di oven dengan suhu 580 ᵒC dan ditempatkan
pada tiga tempat. Potongan testis dimasukkan ke dalam tiga parafin tersebut setiap parafin
dengan waktu dua jam.

5. Pemblokan, dilakukan dengan menuangkan parafin yang telah dicairkan ke kotak yang terbuat
dari kertas atau teplon. Kemudian testis dimasukkan dan diatur letaknya dengan jarum yang
telah dipanaskan selama waktu infiltrasi yaitu dua jam untuk setiap parafin.

6. Parafin dibiarkan pada suhu kamar sampai benar-benar padat, kemudian dimasukkan ke
dalam air dingin sampai potongan testis terlihat dan disimpan atau didinginkan di mesin
pendingin dengan suhu 4-6 ᵒC sampai proses pemotongan.
7. Pemotongan dilakukan dengan mengeluarkan parafin yang berisi potongan testis dari
cetakannya. Parafin yang berisi potongan testis ditempelkan pada balok kayu dengan
menggunakan balok kayu yang sudah dipanaskan.

8. kemudian di parafin objek dipasang mikrotom sliding. Pisau mikrotom dipasang dengan tepat,
kemudian diatur ukuran ketebalan dan mikrotom diberi pelumas. Parafin berisi testis dipotong
setebal lima mikron.

9. Penempelan dilakukan dengan memindahkan lembaran jaringan yang paling baik ke dalam air
hangat (suhu 40-45 ᵒC) selama beberapa detik dengan menggunakan kertas karton sampai
mengembang sempurna.

10. Dengan gerakan menyendok, lembaran jaringan diambil dengan objek glas dan ditempatkan
di tengah pada sepertiga atas atau bawah.

11. Object glass yang berisi jaringan dimasukkan ke dalam inkubator (suhu 370C) selama 24
jam atau plat panas selama satu jam (suhu 50-600C) sampai jaringan melekat sempurna.

12. Melakukan Pewarnaan, dapat dilakukan dengan Hematoxylin Eosin (HE). Preparat
direndam dengan xylol I-III sampai parafin yang menempel pada kaca objek larut atau hilang,

13. preparat kemudian dimasukkan ke dalam alkohol seri 100%, 96 %, selama dua sampai tiga
menit, preparat dimasukkan ke dalam HE selama dua sampai lima menit. Preparat dicuci
dengan menggunakan air mengalir sampai preparat berwarna biru.

14. Diferensiasi dilakukan dengan pengamatan menggunakan mikroskop. Apabila belum cukup
terwarnai maka kembalikan lagi preparat ke dalam larutan HE dan apabila terlalu tua maka
preparat dimasukkan ke dalam pewarna regresif, yaitu alkohol 70 % yang mengandung 0,5 %
HNO3 sebanyak tiga sampai lima celupan.
15. Preparat dicuci kembali dengan air mengalir selama tiga smapai lima menit. kemudian
Preparat dimasukkan ke dalam larutan scoot selama tiga menit. Lalu cuci kembali dengan air
mengalir selama tiga sampai lima menit.

16. Preparat dimasukkan kembali ke dalam alkohol seri dengan konsentrasi 23 70 % dan 96 %
untuk beberapa kali celupan, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 100 % selama tiga
menit.

17. Dilanjutkan kembali pencelupan preparat ke dalam campuran alkohol 100 % dengan xylol
selama dua sampai tiga menit. Sebelum xylol mengering, preparat ditutup dengan mengoles
bahan mounting atau canada balsam untuk menutup object glass, kemudian ditutup dengan
cover glass dan mencegah jangan sampai terbentuk gelembung-gelembung udara.

18. Jaringan siap dilihat di bawah mikroskop.

B. Metode Preparat Parafin Ovarium Mencit (Mus musculus)
Sebelum dilakukan pembedahan mencit terlebih dahulu dibius dengan kloroform,
kemudian setelah mencit tidak bergerak lagi mulailah dilakukan pembedahan pada bagian
ventral tubuh mencit secara vertikal. Spesimen dibuka perutnya dan diambil ovariumnya.
Ovarium yang telah diambil segera difiksasi dengan larutan formalin 10% atau 10% formolsaline
(1 bagian formalin dalam 9 bagian NaCl – fisiologis) di dalam botol. Perbandingan volume
spesimen dengan larutan formalin 1 : 10, guna mendapatkan hasil fiksasi yang sempurna.
Adapun tahapannya sebagai berikut :

1. Trimming Spesimen berupa ovarium dicuci bersih dengan air mengalir untuk menghilangkan
larutan fiksasi, yang sebelumnya spesimen difiksasi terlebih dahulu dengan larutan fiksatif
formalin 10 % dengan perbandingan antara volume spesimen dengan larutan 1 : 10 untuk
mendapatkan hasil yang baik.

2. Kemudian jaringan specimen dipotong setebal 2 – 4 mm menggunakan pisau skapel No. 22-
24. Potongan jaringan tersebut dimasukkan ke dalam embedding casette, tiap embedding
cassette berisi 1 – 5 buah potongan jaringan yang disesuaikan dengan besar kecilnya potongan.
Kemudian dicuci di bawah air mengalir selama 30 menit.

3. Dehidrasi Embedding cassette diletakkan di atas tisu untuk mengeringkan air. Kemudian
diberi perlakuan sebagai berikut secara berurutan pada tabel berikut :
Tahap Waktu Zat Kimia
Dehidration 2 jam Alkohol 80%
2 jam Alkohol 95%
2 jam Alkohol 95%
Clearing 1 jam Alkohol absolut I
1 jam Alkohol absolut II
1 jam Alkohol absolut III
1 jam Xylol I
1 jam Xylol II
 1 jam Xylol III
Impregnasi 2 jam Paraffin I
2 jam Paraffin II
2 jam Paraffin III

4. Embedding, Setelah proses dehidrasi, maka jaringan yang berada dalam embedding casette
dipindahkan ke dalam ”base mold”, kemudian diisi dengan paraffin cair (paraplast)
dimasukkan ke dalam cangkir logam dan dimasukkan dalam oven dengan suhu di atas 580C.

5. Tuangkan paraplast cair ke dalam pans. Jaringan satu persatu dipindahkan dari embedding
cassette ke dasar pans dengan mengatur jarak satu dengan yang lainnya. Pans dimasukkan
atau diapungkan di dalam air.

6. Paraplast yang berisi jaringan dilepaskan dari pans, paraplast dipotong-potong sesuai dengan
letak jaringan dengan menggunakan skalpet atau pisau hangat. Kemudian diletakkan pada
balok kayu berukuran 3 x 3 cm.

7. Jaringan yang sudah diletakkan pada balok kayu atau casette disebut blok paraffin. Fungsi
dari balok kayu atau casette adalah untuk pemegang pada saat blok dipotong pada mikrotom.

8. Cutting, Proses cutting dilakukan di dalam ruangan dingin. Cutting adalah proses pemotongan
jaringan dengan menggunakan mikrotom yang terlebih dahulu didehidrasi. Sebelum
dipotong, blok terlebih dahulu didinginkan, pemotongan dilakukan secara kasar dan halus,
selanjutnya blok dipotong dengan ketebalan 4 -5 µm.

9. Setelah blok dipotong, pilih lembaran yang baik, apungkan pada air dan kerutannya
dihilangkan dengan cara salah satu sisi lembaran jaringan tersebut ditekan dengan ujung
jarum, di sisi lain ditarik dengan kuas runcing.
10. Lembaran jaringan tersebut ke dalam waterbath selama beberapa detik sampai menggembung
sempurna. Kemudian lembaran jaringan tersebut dipindahkan ke dalam waterbath selama
beberapa detik sampai menggembung sempurna. Dengan gerakan disedot, jaringan tersebut
diambil dengan slide bersih dan tempelkan di tengah atau sepertiga atas/bawah. Dicegah agar
jangan sampai ada gelembung udara di bawah jaringan.

11. Setelah itu slide yang telah berisi jaringan ditempatkan pada inkubator (370C) selama 24 jam
sampai jaringan melekat sempurna pada slide. Kualitas hasil cutting sangat tergantung pada
keterampilan dan pengalaman serta pengetahuan yang mendalam tentang peralatan yang akan
dipakai dan karakteristik jaringan yang akan dipotong.

12. Setelah pembuatan slide preparat selesai, dilakukan pengamatan dibawah mikroskop untuk
melihat preparat yang terbaik sebelum dilakukan pewarnaan.

13. Proses selanjutnya adalah pewarnaan dengan menggunakan pewarna HE, proses pembuatan
pewarnaan HE yaitu, Bahan pewarnaan :
a. Hematoxylin kristal : 5 g
b. Alkohol Absolut : 50 ml
c. Ammonium (potassium alkena) : 100 g
d. Aquadest : 1000ml
e. Mercury oxide : 2,5 g
Cara kerja :
Larutan potassium alkena (ammonium) dimasukkan ke dalam air dan dipanaskan,
kemudian ditambahkan Hematoxylin kristal yang telah dilarutkan pada alkohol absolut.
Campuran larutan tersebut dididihkan selama 1 menit sambil diaduk, lalu secara perlahan-
lahan. Tambahkan mercury oxide sampai berwarna jingga gelap. Setelah itu, larutan
dikeluarkan dari panas dan segera didinginkan. Untuk memperjelas pewarnaan inti
ditambahkan 2-4 ml asam asetat glasial per 100 ml larutan. Larutan ini perlu disaring
sebelum digunakan. Dalam proses pewarnaan secara berurutan slide dimasukkan ke 36 dalam
zat kimia di bawah ini dengan waktu sebagai berikut, seperti pada tabel berikut :
 Zat Kimia Waktu
Xylol I 5 menit
Xylol II 5 menit
Xylol III 5 menit
Alkohol Absolut I 5 menit
Alkohol Absolut II 5 menit
Aquades 1 menit
Harris Hematoxylin 20 menit
Aquades 1 menit
Acid alkohol 2 – 3 celupan Aquades 1 menit
Aquades 15 menit
Eosin 2 menit
Alkohol 96% I 2 menit
Alkohol 96% II 3 menit
Alkohol Absolut III 3 menit
Alkohol Absolut IV 3 menit
Xylol IV 5 menit
Xylol V 5 menit

14. Mounting, Setelah jaringan pada slide diwarnai, dilakukan mounting dengan cara
meneteskan bahan mounting (canada balsam) sesuai dengan kebutuhan dan ditutup dengan
cover glass dengan cepat agar tidak ada gelembung udara yang terbentuk.

15. Pembacaan Slide Dengan Mikroskop Slide yang telah jadi diperiksa dibawah mikroskop
sinar dengan pembesaran 40x, 100x, 200x atau 400x. Pada hasil slide yang baik, akan terlihat
inti sel berwarna biru dan sitoplasma berwarna merah jambu. Hasil pengamatan yang
didapatkan, dicatat dalam bentuk data tabel.