PENGOLAHAN JARINGAN

Tujuan
Jaringan yang telah difiksasi dan dipotong-potong menurut ukuran semestinya serta
telah dimasukkan ke dalam kaset,selanjutny di “olah” sehingga berubah menjadi
jaringan yang padat dan kaku agar dapat dipotong amat tipis,4-6 mikron menggunakan
alat pemotong yang disebut mikrotom.
Tahap-tahap “pengolahan” jaringan
1. Dehidrasi
2. Penjernihan (clearing)
3. Impregnasi
4. Penanaman “ embedding

DEHIDRASI

Tindakan ini bertujuan mengeluarkan air dari dalam jaringan.

Akibat fiksasi jaringan di dalam formalin 10%, maka jaringan mengandung banyak
air.
Hal ini menghalangi impregnasi (penyusupan) lilin parafin ke dalam jaringan.
Agar impregnasi berjalan baik, maka terlebih dahulu air dikeluarkan dari
jaringan:dengan cara merendam jaringan di dalam larutan yang dapat menarik air
keluar.
Umumnya digunakan ALKOHOL sebagai penarik air (dehidratyng agent atau dehydrant)

PENJERNIHAN

 Setelah dilakukan dehidrasi, maka jaringan telah dibebaskan dari air, tapi jadi
mengandung alkohol.
 Lilin parafin bersifat tidak dapat larut dalam alkohol,maka impregnasi masih tidak
dapat berlangsung baik.
 Oleh karena itu perlu suatu larutan yang dapat bercampur baik dengan alkohol
maupun dengan lilin parafin sebagai PERANTARA, sehingga impregnasi dapat
berlangsung.
 Umumnya dipilih larutan BENZOL sebagai “perantara”
 Larutan BEZOL dapat menaikkan indeks refraksi jaringan, sehingga jaringan mejnadi
lebih transparan/jernih.
 Larutan benzol ini disebut sebagai “CLEARING AGENT”.

IMPREGNASI LILIN PARAFIN

Yaitu menyusupnya LILIN PARAFIN ke dalam jaringan menggantikan BENZOL yang telah
ada di dalam jaringan.
Ketiga tahap (DEHIDRASI, PENJERNIHAN, IMPREGNASI) berjalan dalam keadaan suhu
sekitar 60-65 derajat Celcius, terutama untuk mencairkan lilin parafin dan
memudahkan penyusupan.
Bila jaringan yang mengandung lilin parafin didinginkan, maka jaringan menjadi
kaku.

Penanaman (EMBEDDING) Jaringan

Jaringan yang mengandung lilin parafin tersebut dimasukkan/ditanam di dalam cairan
lilin parafin panas yang disediakan dalam kotak-kotak kecil serupa kotak pencetak
es.
Bila di dinginkan maka terbentuklah blok parafin yang mengandung jaringan di
dalamnya.
Tahap dehidrasi selain alkohol dapat pula dipakai bahan lain sebagai
dehidrant, contoh:

Aceton
 Pyridine
 Dioxane
 Butanol
 isopropanol

Tahap Penjernihan, bahan lain yang dapat di pakai sebagai “Clearing agent” adalah:

Xylene
 Toulene
 Chloroform
 Cedar wood oil
 ALAT- ALAT yang diperlukan:
Pengolahan jaringan bisa dilakukan secara manual maupun otomatis.

CARA MANUAL:
Jaringan harus dipindah-pindahkan dari satu larutan ke larutan lain oleh orang
yang bertugas.

ALAT YANG DIPERLUKAN:

1. Inkubator/steamer
2. bejana gelas tahan panas (beaker glass)
3. Pinset
4. pencetak blok parafin.

CARA OTOMATIS:
Jaringan dipindah-pindahkan secara otomatis dari satu larutan ke larutan
lainnya,dan digoyang2kan terus menerus secara otomatis untuk mempercepat
pengolahan.

ALAT OTOMATIS:

1. Histokinette Tissue Processing Machine

2. Pinset
3. pencetak blok parafin
4. inkubator

CARA2 PROSSESING JARINGAN:

Jaringan di dalam kaset dimasukkan ke dalam gelas beaker yang berisi larutan
formalin 10% sampai terendam. Masukkan ke dalam inkubator/steamer pada suhu 60
derajat selama 1 jam.
1. Larutan diganti dengan alkohol 70%, selama ¾ jam.
2. Larutan diganti dengan alkohol 80%, selama ¾ jam.
3. Larutan diganti alkohol 95%, selama 1,5 jam.
4. Larutan di ganti alkohol 100%, selama 2 jam.
5. Larutan di ganti aceton, selama 1,5 jam.
6. Larutan diganti aceton II , selama 1,5 jam.
7. Larutan diganti aceton III, selama 2 jam.
8. Larutan diganti Benzol, selama ½ jam.
9. Larutan diganti Benzol II, selama 3 Jam.
10. Jaringan dipindahkan ke dalam gelas beaker berisi lilin parafin cair, simpan
dalam inkubator selama 3 jam.
11. Jaringan di masukkan ke dalam cetakan yang berisi lilin parafin panas,
selanjutnya didinginkan dan segera lilin akan membeku dengan jaringan di dalamnya.

PEMAKAIAN TISSUE PROCESSOR

I. RUANG LINGKUP
Kegiatan pemakaian alat oleh seluruh pihak FKH UGM dan non-FKH UGM di Laboratorium Patologi.

II. PRINSIP
Proses dehidrasi jaringan, untuk mengeluarkan air, clearing, dan impregnasi, sistem automatis

III. PERALATAN
Tissue processor merek Leica, model/type : TP1020

IV. CARA KERJA

1. Pastikan listrik dalam keadaan ON

2. Tekan tombol power UPS dan tombol di belakang Tissue Processor
3. Tekan tombol naik (↑), setelah naik pasang camber yang telah bersisi embedding cassette pada pengaitnya
4. Cek bahan kimia (formalin 4%, alkohol, xylol), dan paraffin dalam kondisi cukup
5. Tekan tombol turun (↓), setelah turun tekan tombol Start, tekan tombol kanan (→) jika sdh muncul waktu
(Start 0-15:30), atur pengaturan waktu dengan menekan tombol kanan (→) atau kiri (←) (mengatur
jam/menit) dan tekan + (menambah) atau – (mengurangi).
Angka 0 pada Start menunjukkan proses dimulai hari ini sesuai jam yang dikehendaki, angka 1 berarti proses
dimulai 1 hari berikutnya, angka 2 berarti 2 hari berikutnya.
6. Tekan tombol start
7. Tekan tombol kunci selama10 detik, selanjutnya proses berjalan secara automatis (16,5 jam). Misal : Program
dimulai pukul 16.00 wib dan akan berakhir pada pukul 08.30 wib.
 8. Hari berikutnya pukul 08.30 wib, tekan tombol kunci 10 detik untuk membuka, tekan tombol stop (2 kali),
tekan tombol naik (↑), setelah mesin naik kemudian angkat camber berisi embedding cassette, letakkan
embedding cassette pada tissue embedding.
9. Tekan tombol putar (ۤ) 1 kali, tekan tombol turun (↓)
10. Tekan tombol OFF pada Power UPS, dan cabut plug dari stop kontak listrik
11. Catat tanggal penggunaan alat, petugas, dan keterangan keadaan alat
12. Bersihkan Tissue Processor

A. Sediaan untuk Pemeriksaan Sitologi

Pada pemeriksaan sitologi yang diperiksa morfologi sel-sel cairan tubuh. Sediaan atau disebut duga preparat
dibuat berupa apusan pada objek glass yang diwarani dengan pewarnaan tertentu.
1. Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Giemza
Tujuan : Terutama yang diperiksa adalah detail dari morfologi untuk memeriksa intisel, untuk melihat apakah
sel tersebut sel normal, sel noeplasma jinak atau ganas.
Sampel : Aspirasi Jarum Halus (AJH), Endapan cairan yang telah disentrifuge
Bahan :
– Larutan pewarna giemza
– Larutan Phosfat buffer (ph 6,8)
– Methanol
Prosedur kerja :
1) Sediaan apus telah benar-benar kering di udara
2) Fiksasi dengan methanol minimal 5 menit
3) Cuci dengan aquadest, biarkan kering di udara
4) Tetesi dengan pewarna Giemsa dengan perbandingan (GZ : Bufer phosfat = 1:4)
5) Cuci dengan aquadest, kering diudara
6) Tutup EZ Mount
2. Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Papaniculo
Metode ini umumya digunakan untuk pewarnaan Papsmear (tapi terkadang ada juga selain papsmear diwarnai
dengan metode ini).
Papsmear digunakan untuk mendignosis Kanker serviks. Melihat ada tidaknya sel ganas
Sampel : apusan daerah peralihan endoserviks.
Bahan:
-Haematoksilin mayer
-EA (Eosin alkohol) 65/EA 36
– Alkohol 95% dan Alkohol absolut
Untuk EA 65 isinya: Eosine Y, Phospotung stic acid, light green, alk. Absolute
Prosedur Kerja :
1) Sedian apusan difiksasi dengan alcohol 95% 15 menit
2) Air mengalir sampai bebas alkohol 5 menit
(rak preparat diletakan di wadah yang di beri air mengalir)
3) Mayer haematoksilin 3-5 menit
4) Air Mengalir 15 menit
5) –Alkohol 95% 10 kali celup
-Alkohol 95% 10 kali celup
6) EA 3-5 menit
7) –Alkohol 95% 5 kali celup
-Alkoho 95% 5 kali celup
– Alkohol absolute 5 kali celup
8) Keringkan diudara
9) Xylol/clearing
10) Tutup dengan EZ mount

Hal-hal yang harus diperhatikan untuk pembuatan sediaan/preparat papsmear:

– Pengambilan sampel harus mendapat sel-sel endoserviks sel-sel metaplasia dan sel-sel skuamosa (komponen
daerah peralihan), harus harus sedikit mungkin mengandung darah.
– Sediaan harus segera difiksasi dengan alkohol 95%. Preparat yang kering belum difiksasi akan menyebabkan
sel-sel rusak. Apabila tempat pengecatan jauh,setelah difiksasi keringkan dan masukkan kewadah yang dapat
menjaga keamanan sediaan.
– Jika menggunakna hairspray tidak boleh terlalu dekat, karena akan menghapus atau tidak terfiksasi dengan
baik.
*Kesalahan pada kriteria yang diatas bisa menyebabkan negatif
palsu.
*Kesalahan pada pewarnaan dan screening dapat menyebabkan positif palsu.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sediaan sitologi dan fiksasinya:
1. Objek glass harus benar-benar bersih, terus beri nomor sesuai data biar tidak tertukar,
2. ¾ luas kaca objek memanjang, kita apus merata,tidak terlalu tebal dan terlalu tipis
3. Segera fiksasi sesuai dengan pewarnaan yang akan digunakan
4. Untuk cairan, disentrifuge dahulu dan kemudian diambil untuk diproses
5. Untuk bahan sputum diambil bagian berwarna dan kental untuk dibuat pulasan. Bagian yang lain bisa
gunakan sebagai sel blog.
B. Sediaan untuk Pemeriksaan Histologi
1. Tahap periksaan dimulai dari penerimaan sampel di tata usaha. Petugas penerima harus mengecek kembali
sampel tidak boleh asal terima.
– Jaringan atau organ yang diterima harus dalam keadaan terfiksasi dengan formalin buffer 10%(perbandingan
jaringan dan cairan fiksasi, 1:9 ) dan ditutup rapat.
* Buffer formalin 10% :
1. formaldehid 40% H.CHO = 100 ml
2. Sodium Phospat monobasic NaH2PO4.H2O = 4 gram
3. Sodium Phopat dibasic Na2HPO4 = 6.5 gram
4. Aquadest = 900 ml
– Identitas pasien harus dilengkapi seperti, nama, umur, jenis kelamin, alamat, pekerjaan,riwayat penyakit,
Dibagian yang ingin diperiksa.
– Jenis sampel sampel harus di Cross check, apa sama jenis sampel yang ditulis dengan yang diterima
– Dan harus di tanya bagai mana menyampaian hasil pemeriksaan, Jika pasien ingin mengambil sampel sendiri
harus ada surat pengantar.
– Nama dan alamat dokter pengirim sampel harus ada,
Dokter pengirim harus diingatkan jika ada yang tidak sesuai kriteria.
2. 2 Pemeriksaan Makroskopis
Pemeriksaan makaroskopis dilakukan oleh dokter tugas analis kesehatan/teknisi laboratorium mendampingi
dokter, melakukan pencatatan hasil pemeriksaan dokter. Pada tahap ini dokter juga akan memotong jaringan
yang dicurigai

Processing Jaringan
Untuk prosessing jaringan memakai alat tissue prosessor automatic yang bekerja ± 18,5 jam(bisa diubah sesuai
kebutuhan). Tahapan prosessing jaringan yaitu, Fiksasi, Dehidrasi, clearing, dan infiltrasi paraffin.

Tahapan kerja pada Tissue Automatics Prosessor

1) Fiksasi
Botol 1. Buffer Formalin 10% 2 jam
2) Dehidrasi
Botol 2. Alkohol 70% 1,5 jam
Botol 3. Alkohol 80% 1,5 jam
Botol 4. Alkohol 95% 1,5 jam
Botol 5. Alkoho absolute I 1,5 jam
Botol 6. Alkoho absolute II 1,5 jam
Botol 7. Alkoho absolute III 1,5 jam
3) Clearing
Botol 8. Xylol I 1 Jam
Botol 9. Xylol II 1,5 Jam
Botol 10. Xylol III 1,5 Jam
4) Infiltrasi paraffin
Botol 11. Paraffin cair I 1,5 jam
Botol 12. Paraffin cair II 2 jam
Jumlah 18,5 jam
Fiksasi
Tujuan : Untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah
terjadi dialysis atau pembengkakan pada rupture.
Rumus yang digunakan untuk memonitor fiksasi baik atau buruk diuji dengan rumus:
d = k √t
d = ketebalan jaringan (mm)
t = waktu yang dibutuhkan/tersedia
k = ketetapan daya fiksir dari atas dan bawah (2 X ketetapan masing-masing fiksasi)
Ketetapan fiksasi formalin 10% = 0.78
Dehidrasi
Tujuan : untuk menghilangkan/menarik air dalam jaringan dengan cara mulai konsentrasi terendah sampai
konsentrasi tinggi.
Clearing
Tujuan : Menarik keluar kadar alcohol yang berada dalam jaringan, memberi warna yang bening pada jaringan
dan juga sebagai perantara mesuknya kedalam paraffin.
Zat yang sering dipakai Xylol, tapi bisa juga dipakai : benzol, benzene, toluol,dll.
Untuk jaringan otak dan limfonoid lebih baik menggunakan koloform.
Infiltrasi paraffin
Tujuan : Mengisi rongga atau pori-pori yang ada pada jaringan setelah setelah ditinggal cairan
sebelumnya(xylol).
Jumlah waktu : 18,5 Jam
4. . Pengeblokkan
Tujuan : Agar mudah dipotong menggunakan mikrotom untuk mendapatkan irisan jaringan yang sangat tipis
(sesuai yang diharapkan).

Cara Kerja :
1) Hangatkan paraffin cair, pinset, dan penutup cetakan
2) Parafin cair dituangkan kedalam cetakan
3) Jaringan dari prosessing dimasukan kedalam cetakan yang telah disi paraffin cair, tekan jaringan agar
semakin menempel di dasar cetakan.
4) Tutup cetakan diambil, letakkan diatas cetakan dan di tekan.Pasang etiket di pinggir.
5) Biarkan sampai membeku
6) Setelah beku, keluarkan dari cetakan. Rapikan sisi-sisi blog. Ganti etiket dengan yang permanen

5. Pemotongan dengan Mikrotom

1) Sebelum pemotongan Masukan kedalam plastik yang diisi air dan letakkan di freezer ±15 menit atau diberi
batu es.
2) Blok dijepit pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikroto.
Kemiringan : ±300 , Tebal blok paraffin ±2-5mikron.
3) Hasil pemotongan (berupa pita/irisan tipis yang saling bersambung) dimasukkan kedalam waterbath yang
diisi air yang sudah dihangatkan 50 0 C, kemudian diambil dengan kaca objek (Meletakkan potongan di
waterbath tidak boleh terbalik).

Cttn : Pisau dan waterbath bisa diberi alcohol 50% untuk menurunkan tegangan permukaan yang membantu
merentangkan pita.
Objek glass jangan diolesi albumin gliserin karena biasanya albumin bila diinkubasi akan mengeras.menjaga
agat jangan lepas saat pengecatan
6. Inkubasi
Tujuan : Menguapkan air yang terbawa oleh hasil potongan hingga jaringan menempel lebih kuat.
Cara kerja : inkubasi preparat di atas hot plate dengan suhu±50 0 C(dibawah titik cair paraffin) selama 15 menit
 · Sebaiknya dialasi dengan kertas merang.
 · Untuk pengecatan imunnohistokima inkubasi 390C selama 1 malam
7. Pengecatan
Umumnya dalam pengecatan histopatologi digunakan cat Hetatoxylin-Eosin (HE) disamping cat khusus (PAS,
gomori, ZN, Malory, dll) dan cat yang lebih khusus yaitu immunohistokimia (ER, PR, CD20, LMP, dll)

Proses pengecatan :
1) Deparafinisasi
Preparat masuk ke Xylol I, II, dan III masing-masing 3 menit
Setelah itu dilap pinggir jaringan dengan kain kasa.
2) Rehidrasi
Preparat masuk ke alcohol 100%, 95%, 80%, 70% masing-masing 2 menit
3) Preparat masuk ke air mengalir 3 menit
(air mengali ditampung dalam wadah )
Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup
4) Pengecatan Inti 7 menit
Preparat masuk ke dalam Meyer hematoksilin
5) Preparat masuk ke air mengalir 3 menit
(air mengali ditampung dalam wadah )
Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup
6) Counter Stain
Preparat masuk ke larutan eosin 7 celup
7) Preparat Masuk ke air wadah I, II, dan III 3 celup
8) Dehidrasi
Preparat masuk ke dalam alcohol 70 %, 80%, 95%,100% 3 celup
Setelah itu Dilap dengan kain kasa sekitar jaringan
dan tunggu sampai kering
9) Clearing
Preparat masuk Ke Xylol I, dan II masing-masing 2 menit
10) Mounting
11) Preparat diberi 1 tetes entelan dan ditutup objek glass

Deparafinisasi
Tujuanya : Berfungsi melarutkan/melepaskan paraffin yang melekat pada preparat.
Rehidrasi
Berfungsi menghilangkan xylol yang terbawa oleh preparat dan memasukan air kedalam jaringan
Air mengalir
Melepaskan sisa cat atau cairan yang terbawa sebelumnya
Meyer Hematoksilin
Memberikan warna biru pada inti sel
Eosin
Memberi warna merah pada sitoplasma, jaringan ikat,dll
Dehidrasi
Melepaskan aira yang terbawa preparat
Clearing
Melepastan alcohol yang terbawa oleh preparat dan memberi warna bening pada preparat
Mounting
Memberi warna cerah dan sebagai pelindung dan pengawet jaringan dari mikroba dan bakteri.