Pendahuluan:

Belajar Histologi

Ilmu Histologi

Histologi berasal dari kata histos yang berarti jaringan dan logos yang berarti

ilmu, sehingga histologi dapat diartikan sebagai ilmu yang mempelajari tentang

jaringan tubuh. Jaringan sendiri merupakan kumpulan sel yang memiliki bentuk,

susunan dan fungsi yang sama. Jaringan dibagi menjadi dua golongan, yaitu

jaringan germinatif dan jaringan somatis. Di mana jaringan germinatif merupakan

jaringan yang menghasilkan sel benih atau gamet dan terletak di dalam gonad,

sedangkan jaringan somatis adalah jaringan tubuh (Lesson, 1985).

PRAKTIKUM HISTOTEKNIK

1 PRAKTIKUM HISTOTEKNIK

Tujuan:

1. Melihat pada demo teknik-teknik Histologi, termasuk persiapan sampel dan

penggunaan mikroskop

2. Latihan membuat preparat histologi jaringan masing-masing yang dapat

dianalisa lanjut dengan mikroskop

Histoteknik adalah metoda membuat sajian dari spesimen tertentu melalui suatu

rangkaian proses hingga menjadi preparat histologi yang baik dan siap untuk

dianalisis. Spesimen dapat berasal dari manusia dan hewan. Preparat yang baik

dapat digunakan untuk mempelajari peran sel/jaringan dalam keadaan fisiologis atau

patologis, mempelajari perubahan sel/jaringan akibat suatu perlakuan pada

penelitian, dan alat bantu diagnosis penyakit. Preparat yang baik dapat memberikan

hasil yang akurat untuk menjawab pertanyaan riset. Untuk mencapai tujuan tersebut,
preparat harus dapat memberikan gambaran tentang bentuk, besar, dan susunan

sebagaimana sel/jaringan tersebut hidup.

Teknik Histologi

Teknik Histologi adalah tahapan-tahapan dalam melakukan teknik sito-histologi

dimulai dari mendapatkan jaringan sampai dihasilkan preparat yang siap diperiksa

secara mikroskopis

Teknik Pembuatan Preparat

            Preparat histologi dapat dibuat dengan berbagai cara yang berbeda-beda

tergantung pada tujuan pembuatan preparat dan organ yang akan diamati. terdapat

beberapa tahapan dalam pembuatan preparat diantaranya meliputi nercose, sectio,

labelling, fiksasi, washing, dehidrasi, clearing, infiltrasi, embeding, sectioning,

affixing, staining, mounting, dan labelling. Selain itu ada tiga macam preparat

histologi yang sesuai dengan tujuannya dan sering di gunakan dalam praktikum,

yaitu preparat apus, preparat bentang, dan preparat paraffin. Pengklasifikasian ini

juga didasarkan atas jenis organ yang akan diamati (Carlos, 1998).

Berikut merupakan beberapa tahapan dalam pembuatan preparat parafin :

1.     Narcose adalah upaya untuk membuat percobaan dalam keadaan pingsan.

1. Sectio adalah pembedahan terhadap contoh.

2. Labelling bertujuan untuk menghindari kesalahan dalam pengamatan.

3. Fiksasi adalah tindakan untuk mengawetkan jaringan/organ agar tidak

rusak baik bentuk maupun stuktur.

4. Washing adalah membersihkan organ dari larutan fiksasi, kecuali fiksasi

yang di gunakan mengandung alkohol.

5. Dehidrasi adalah suatu cara untuk menarik molekul air dari sel jaringan

dengan menggunakan alkohol.

 6. Clearing adalah suatu upaya untuk menarik alkohol dari jaringan dan

menggantikannya dengan xylol.

7. Infiltrasi adalah suatu upaya memasukkan parafin cair ke dalam rongga sel

jaringan atau organ.

8. Embending adalah kegiatan pencetakan organ yang telah diinfiltrasi.

9. Sectioning adalah kegiatan mengatur blok parafin sehingga sesuai dengan

pisau mikrotome yang di pakai.

10. Affixing adalah upaya merekatkan hasil potongan pada gelas kaca yang

bebas lemak dengan perekat yang terdiri dari campuran asam cuka,

albumin dan aquades.

11. Staining adalah melakukan pewarnaan terhadap organ yang telah di sayat

dengan mikrotome.

12. Mounting adalah menutup gelas benda yang berisi organ dengan Canada

balsam satu tetes kecil.

13. Labelling adalah pencatatan kembali tentang detail dari jaringan pada

gelas kaca seperti nama organ, asal sampel, tanggal pembuatan,

pewarnaan, dan abnormalitas.

Untuk mempertahankan struktur fisik jaringan agar tetap terlihat jelas saat diamati,

preparat harus diawetkan terlebih dahulu dan potongan jaringan yang akan diamati

harus diolah dengan tepat sebelum atau secepat mungkin setelah diangkat dari

tubuh. Pengolahan yang dilakukan pada preparat dan jaringan tersebut merupakan

fiksasi. Fiksasi merupakan proses merendamkannya potongan organ ke dalam

larutan fiksasi, hal tersebut dilakukan agar dapat mengawetkan sebanyak mungkin

morfologi dan ciri molekulnya. Untuk memperoleh irisan yang tipis jaringan harus

diinfiltrasi sesudah fiksasi dengan parafin. Proses embeding melalui dua tahap
utama yaitu dehidrasi dan clearing. Air mula-mula dikeluarkan dari fragmen yang

dipendam dengan mencelupkannya secara berturut-turut ke dalam alkohol kemudian

dengan xylol. Jaringan sulit diamati tanpa dipulas dibawah mikroskop cahaya

karena  hampir semua jaringan tidak berwarna. Hampir semua pewarna dalam studi

histologi bersifat sebagai senyawa asam atau basa. Dari semua pewarna yang ada,

kombinasi hematoksilin dan eosin paling banyak dipakai, karena hematoksilin dan

eosin memulas unsur jaringan sehingga dapat menampakkan berbagai unsur

jaringan yang akan diamati. Hematoksilin memulas nukleus sel dan sitoplasma

menjadi merah dan kolagen menjadi merah muda. Banyak pewarna lain yang

dipakai dalam berbagai prosedur histologi, meskipun mereka berguna untiuk

menampakkan berbagai unsur jaringan, namun tidak menunjukkan sifat kimiawi dari

jaringan yang diamati (Carlos 1998).

Tahapan Teknik Sito-Histologi

1. Mendapatkan Jaringan

2. Fiksasi

3. Dehidrasi

4. Clearing

5. Embedding

6. Sectioning/Cutting

7. Mounting

8. Staining

9. Labeling
Mendapatkan Jaringan

 Jaringan harus diduga tumor atau kelainan

 Jaringan harus sudah difikasasi sebelum 6 jam setelah kematian, bisa terjadi

maserasi

 Pemotongan menggunakan pisau tajam ukuran biasanya (1,5x1x0,5) cm 3

 Mendapatkan Jaringan

 Harus segera dimasukkan ke dlm larutan fiksasi (Volume 40x) selama 1

malam

 Tidak boleh dicuci dg air (terjadi perubahan tekanan osmotik

 Tidak boleh disimpan dlm NaCl 0,9 % -maserasi

 Tidak boleh dibekukan-pembentukan kristal es dlm sitoplasma

 Jaringan berbentuk tulang harus didekalsifikasi agar lunak dg HCl 0,5 % 

Fiksasi Jaringan

Fiksasi Jaringan adalah Proses mengawetkan jaringan agar awet dan kondisinya

sama seperti hidup. Dilakukan dengan merendam jaringan ke lart fiksasi

(volume min 20x besar jar) selama 24  jam

Fiksasi Jaringan

Manfaat Fiksasi :

•Sel & jar keadaannya seperti  hidup

•Membunuh Bakteri

•Mematikan sel secara serentak

 •Mengeraskan jaringan

•Melindungi sel dari proses selanjutnya

•Mempermudah pengecatan

•Melindungi sel/jar dari autolysis dan putrefaction

Fiksasi Jaringan

Berdasar Cara Kerja :

 Precipitant  fixatives (mengkoagulasikan protein)

ex : Mercuri klorida, alkohol

 Non Precipitant fixatives (mendenaturasikan protein)

ex : Potassium diphosphat

Berdasar Tujuan Pemakaian :

 Micro Anatomical Fixatives (melihat komponen jar scr keseluruhan)

ex : susa, Bouin, Zenker

 Cytological Fixatives :melihat komponen  inti, ex : Fleming, Corney,

Sanpelice.melihat komponen sitoplasma,  ex : Formaldehida (5% Formal

saline), Fleming dikurangi asam asetat glasial,

BERDASARKAN KOMPOSISINYA

 Simple fixative (Zat fiksatif  yang dipakai tunggal) ex : Mercuri Chlorida,

Alkohol, Picric Acid, Chromic Acid

 Compound  fixatives (Zat fiksatif yang digunakan secara gabungan) ex :

NaCl Formalin, Suza, Zenker, dsb.

Kecepatan penetrasi zat Fiksatif  Berbeda-beda

 Paling cepat : asam acetat glacial

 Palinglambat:OsmiumTetraoksida(OsO4)
 SIFAT ZAT FIKSATIF

    Alkohol                                             - Mengeraskan jaringan.

                                                               - Daya penetrasi kuat.

                                                               - Melarutkan kromatin

    Asam Asetat Glasial- Melunakan  jaringan.

                                                               - Daya penetrasi kuat.

                                                               - Memfiksasi  kromatin

Dehidrasi adalah Proses penarikan air secara aktif dari dalam jaringan

Proses Dehidrasi

Untuk memudahkan proses infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan alkohol

dari konsentrasi rendah-tinggi

Proses Dehidrasi

Contoh Proses Dehidrasi

 alkohol 70%.......... 1 hari

 alkohol 80%........... 1 hari

 alkohol 90%........... 1 hari

 alkohol 95% .......... 1 hari

 alkohol 95% .......... 1 hari

 alkohol 100% ........ 1 hari

 alkohol 100% ........ 1 hari

 Alkohol dapat dimurnikan kembali dengan cuprisulfat (CuSO4) 

Cuprisulfat -putih (tak mengandung air) akan berubah menjadi biru (mengandung

air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah
disimpan beberapa hari. Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air

dapat di hilangkan airnya dengan cara memanaskan.

Proses Dehidrasi

Lamanya waktu tergantung pada :

 Besar kecilnya jaringan

 Konsentrasi jaringan

 Macam zat fiksasi yang dipakai

 Sifat clearing agent yang dipakai

Proses Clearing

Syarat clearing agent harus melarutkan alkohol dan parafin

Clearing agent yang biasa dipakai :

 Xylene.

 Benzene

 Toluen

 Chloroform

EMBEDDING

Embedding adalah Proses memasukkan jaringan ke dalam parafin cair untuk dibuat

blok yg padat

Meliputi :

 Impregnation

 Blocking

 Trimming
Proses Embedding

Impregnation.

proses penggantian larutan toluen dengan parafin cair

Blocking.

Memasukkan jaringan ke dalam parafin cair - dipadatkan (menurunkan suhu

parafin)-dicetak

Trimming.

Meratakan/merapikan jaringan yg telah diblock parafin dengan menggunakan pisau

atau langsung dengan mikrotome, sehingga pada saat pemotongan didapatkan

potongan bentuk jaringan yang baik

Proses 

SECTIONING / CUTTING

Sectioning adalah proses pemotongan jar dengan mikrotom-ukuran sangat tipis 4-10

µ- tembus cahaya saat diperiksa dengan mikroskop

Diperhatikan :

 Pisau harus tajam

 Blok jaringan harus dingin

 Ketebalan pemotongan harus disesuaikan dengan jenis jaringan

Proses Sectioning

Dinginkan pada lemari es / cold plate - akan terlepas dari cetakan bloknya dan

tempatkan pada hold mikrotome untuk dipotong  (ketebalan 3 – 5 µ)

-membentuk lembaran pita

MOUNTING(Menempelkan potongan jaringan yg baik ke obyek glass)

Proses Mounting

 Obyek glass diberi albumin agar Jar menempel dg baik

 Dimasukkan ke dalam water bath suhu 30 0C - lembaran pita tidak

melipat

 Bila sudah menempel dikeringkan/ diriskan (Bisa dg Hot Plate)

 Stretching tissue in warm water.

Staining (mewarnai preparat)

Staining

Macam pewarnaan berdasarkan asal zat warna :

Natural Dyes,

Acid Carmine : ekstrak serangga betina yang hidup di pohon kaktus di daerah tropis.

Hematoxyline : getah pohon Haematoxyline campechianum Syntetic Dyes Benzene,

Quinone, Anilline.

Staining

Prinsip Kerja Pewarnaan :

 Secara umum zat warna yang bersifat asam akan mewarnai bagian sel yang

bersifat basa dan sebaliknya

 Cat netral (gugus asam dan gugus basa keduanya berwarna)

 Misal :Romanowsky ,(Camp methylen Blue & Eosin)

 Staining

Berdasarkan waktu :

 Direct Staining, molekul zat warna langsung ditangkap oleh jaringan, misalnya

Eosin

 Indirect Staining, molekul zat warna baru bisa ditangkap oleh jaringan jika

menggunakan zat perantara yang disebut Mordant, misalnya Haematoxyline

menggunakan Potasium Alum sebagai mordantnya.

Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)

Menggunakan 2 macam zat warna yaitu

 Hematoksilin -memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik)

 Eosin yang merupakan counter staining hematoksilin, memulas sitoplasma

sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan

nuansa yang berbeda. 

Interpretasi hasil :

 Inti sel bewarna   biru

 Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna

pada komponen tertentu

Teknik pewarnaan jaringan :

       1.       Xylol selama 3 menit sebanyak 3 kali pada wadah yang berisi xylol yang

berbeda

       2.       Alkohol absolute selama 3 menit

       3.       Alkohol 96% selama 3 menit

       4.       Alkohol 70% selama 3 menit

       5.       Dicuci dengan air mengalir selama 5 menit 

       6.       HE (Hematoxylin) selama 3-5 menit

       7.       Dicuci dengan air mengalir selama 5 menit

       8.       Dicelupkan ke dalam Alkohol Asam 3-5 kali, untuk menghilangkan sisa

hemtoxylin sehingga jaringan tidak terlihat kebiruan

       9.       Dicuci dengan air mengalir selama 5 menit

       10.   Dicelupkan ke dalam Lithium Carbonat sebanyak 3-5 kali 

       11.   Dicuci dengan air mengalir selama 5 menit

       12.   Eosin selama 10-30 menit

       13.   Alkohol 70% selama 3 menit

       14.   Alkohol 96% selama 3 menit

       15.   Xylol selama 3 menit sebanyak dua kali pada wadah yang berisi xylol berbeda

       16.   Diberi entelan agar merekat kuat dan bias untuk disimpan

LARUTAN PENGAWET

Pengawetan (fiksasi) adalah stabilisasi unsur penting pada jaringan sehingga unsur

tersebut tidak terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya.

Fiksasi yang benar adalah dasar dari semua preparat yang baik. Efek fiksasi

terhadap jaringan yang diproses adalah menghambat proses pembusukan dan

autolysis, pengawetan jaringan, pengerasan jaringan, pemadatan koloid, diferensiasi

optik, dan berpengaruh terhadap pewarnaan. Sejumlah faktor akan

mempengaruhi proses pengawetan yaitu dapar, penetrasi, volume pengawet,

konsentrasi, interval waktu, suhu, dan jenis larutan pengawet.

Ada 5 kelompok utama bahan pengawet yang dikelompokkan menurut mekanisme

kerja, aldehydes, mercurials, alcohols, oxidizing agents, dan picrates.

Larutan formalin adalah golongan aldehydes dan merupakan larutan fiksasi yang

paling sering digunakan. Larutan ini akan mengawetkan struktur halus (fine

structures), fosfolipida,dan beberapa enzim dengan sangat baik.

Formula yang sering digunakan adalah

Neutral Formalin

Formalin ................................................................. 10 ml

Acid sodium phosphate monohydrate.................... 0,40 gr

Anhydrous disodium phosphate............................ 0,65 gr

Akuades ..........................................................ad 100 ml

Larutan pengawet lainnya yang sering digunakan adalah larutan Bouin. Larutan ini

mengandung larutan asam pikrat jenuh. Formula larutan Bouin adalah:

Larutan asam pikrat jenuh ....................................................................... 75 ml

Formalin (40% formaldehida)....................................................................25 ml

Bila akan digunakan, tambahkan " asam asetat glasial" ........................... 5 ml

Mengawetkan Jaringan

Cara melakukan pengawetan jaringan ada 2 macam, yaitu supravital/intravital atau

merendam dalam larutan pengawet. Merendam dalam larutan pengawet adalah

yang paling sederhana dan sering dilakukan.

PEMOROSESAN JARINGAN

Setelah jaringan diawetkan, jaringan harus diproses menjadi bentuk yang dapat diiris

dengan mikrotom. Biasanya pengirisan dikerjakan dengan parafin (suatu jenis lilin).

Langkah utama pemorosesan jaringan adalah dehidrasi dan pembeningan.

Jaringan tertentu memiliki struktur yang berbeda dengan kebanyakan jaringan

lainnya.
Jaringan yang mengandung kalsium (tulang) atau jaringan yang keras (kulit) akan

menjalani proses tertentu sebelum proses dehidrasi.

Dehidrasi (Dehydration)

Dehidrasi adalah proses pengeluaran air dari jaringan agar jaringan tersebut dapat

diisi oleh parafin sehingga jaringan dapat diiris tipis. Cairan dehidrasi (dehidran)

dapat berupa alkohol dengan kadar yang meningkat, metanol, sukrosa, dan aseton.

Alkohol dan aseton adalah yang paling sering digunakan.

•Alkohol: Alkohol 70%, 80%, 90%, masing-masing 1 hari; alkohol 95% 2 hari (2x

ganti); alkohol 100 % 2 hari (2x ganti). Aseton: 3 x 20 menit.

Macam-macam Zat Warna Histologi

Berdasarkan sifat

a. Zatwarna asam Garam-garam dari asam pembawa warna dan radikal

basa tak berwarna Misalnya:asamfuchsin, eosin

b. Zat warna basa Garam garam dari basa pembawa warna dan radikal

asam tak berwarna. Misalnya: basic fushsinhematoxylin

Berdasarkan Kemampuan

1. Zat warna substantif mampu langsung mewarnai jaringan. Misalnya: eosin,

safranin, fast green, yanusgreen

2. Zat warna ajektif Berfungsi dengan baik bila dibantu zatlain(zatmordan)

Misalnya: hematoxylin

Macam-macam Zat Warna Histologi Berdasarkan pengaruh zat warna terhadap

obyek

a. Perwarna efektif Hanya mewarnai satu atau beberapa bagian jaringan saja

Misalnya: Toluidinblue untuk jaringan mesenterium yang jelas hanya granula

b. Pewarna difus Mewarnai seluruh jaringan hanya daya serapnya tidak sama

Misalnya: eosin

Macam-macam Zat Warna Histologi Berdasarkan Kemampuan

1. Zatwarna substantif Mampu langsung mewarnai jaringan Misalnya: eosin,

safranin, fast green, yanusgreen

2. Zat warna ajektif Berfungsi dengan baik bila dibantu zat lain(zatmordan)

Misalnya: hematoxylin

Berdasarkan pengaruh zatwarna terhadap obyek

a. Perwarnaefektif Hanya mewarnai satu atau beberapa bagian jaringan saja

Misalnya: Toluidinblue untuk jaringan mesenterium yang jelas hanya granula

b. Pewarna difus Mewarnai seluruh jaringan hanya daya serapnya tidak sama

Misalnya: eosin