1

Melacak Bakteriofag Spesifik E coli dari Air Lingkungan di Kota Bogor

Prosedur kerja :

A. Persiapan Kultur Bakteri

B. Pengambilan Sampel (Air Lingkungan)
C. Isolasi dan Kuantifikasi Bakteriofaga
D. Purifikasi dan Penyimpanan Bakteriofaga
E. Penentuan Kisaran Inang Bakteriofaga

A. Persiapan Kultur Bakteri

- Bakteri Escherichia coli untuk isolasi bakteriofaga diambil dari IPB Culture
Collection dan dari laboratorium terpadu FKH IPB. Identifikasi bakteri dilakukan
pada media Eosin Metylen Blue Agar (EMBA) dan dilanjutkan pewarnaan gram
untuk membedakan jenis gram bakteri gram positif dan gram negatif.
- Persiapan kultur bakteri selanjutnya adalah memastikan fase pertumbuhan bakteri
berada pada fase eksponensial (log phase) yang ditandai dengan optical density
panjang gelombang 600 = 0.6-1.0 (sekitar jam ke-3 sampai jam ke-6) dengan
menggunakan spektrofotometer.

B. Pengambilan Sampel (Air Lingkungan)

1. Metode Preparasi Sampel Air Sungai
a. Sebanyak 4.5 mL sampel air sungai dimasukkan ke dalam botol steril.
b. Masing-masing sampel air sungai ditambah 0.5 mL kultur bakteri inang OD600
= 1 (E. coli jam ke-3 sampai jam ke-6; Log phase 0.6-1.0).
c. Campuran air sungai dan bakteri ditambah 5 mL Nutrient Broth, kemudian
diinkubasi pada suhu 37 derajat celcius selama 24 jam.
d. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kultur disentrifugasi pada kecepatan 5000
rpm selama 20 menit.
e. Supernatan diambil dengan menggunakan syringe dan disaring menggunakan
membran filter ukuran 0.22 um.
f. Hasil filtrasi dimasukkan ke dalam botol steril dan disimpan pada suhu 4 derajat
celcius.
 2

2. Metode Preparasi Sampel Limbah Cair

a. Limbah cair sebanyak 10 mL diambil dari selokan pembuangan limbah,
disimpan di dalam botol steril.
b. Limbah cair disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit.
c. Supernatan diambil menggunakan syringe dan disaring dengan membran filter
ukuran 0.22 um.
d. Sampel disimpan pada suhu 4 derajat celcius.

C. Isolasi dan Kuantifikasi Bakteriofaga

1. Isolasi Bakteriofaga
Tujuan : Untuk mengambil faga dari habitat asal kemudian diperbanyak secara in
vitro.
a. Pengkayaan
Alat dan bahan :
- Erlenmeyer 100 mL
- Syringe
- Membran filter milipore steril ukuran 0.22 um
- Supernatan fag hasil pre-treatment
- Kultur overnight bakteri inang

Langkah kerja :

1. Sebanyak 4.5 supernatan faga dicampurkan dengan 0.5 mL

bakteri inang (OD600 = 1) ke dalam 10 mL media NB.
2. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 derajat celcius
selama 24 jam.
3. Setelah inkubasi, selanjutnya kultur disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 20 menit.
4. Supernatan diambil dengan syringe, kemudian dilakukan
filtrasi menggunakan membran filter miliporesteril ukuran
0.22 um
5. Hasil filtrasi disimpan pada suhu 4 derajat celcius.
 3

b. Pembuatan soft agar

Alat dan bahan :
- Erlenmeyer 250 mL
- Tabung reaksi + sumbat kapas
- Nutrient Broth (NB)
- Agar
- Akuades

Langkah kerja :

1. Sebanyak 0.8 g NB (Difco) ditambahn 0.8 g agar dilarutkan

ke dalam 100 mL akuades.
2. Campuran tersebut dihomogenkan dan dipanaskan hingga
media agar benar-benar larut.
3. Soft agar dimasukkan ke dalam tabung reaksi, masing-
masing dengan volume 5-7 mL.
4. Media soft agar disterilkan pada suhu 121 derajat celcius
selama kurang lebih 20 menit.
5. Media soft agar steril dapat disimpan pada suhu 4 derajat
celcius.
6. Jika soft agar sebelum digunakan sudah memadat, cairkan
terlebih dahulu soft agar tersebut pada air mendidih. Kondisi
tabung harus tetap tertutup untuk menjaga media tetap steril.

c. Pembuatan agar padat

Alat dan bahan :
- Langkah kerja : Botol duran 250 mL
- Cawan Petri
- Nutrient Broth (NB)
- Agar-agar
- Akuades
 4

1. Sebanyak 0.8 g NB (Difco) ditambah 2.2 g agar dilarutkan

ke dalam 100 mL akuades.
2. Campuran tersebut dihomogenkan dan dipanaskan hingga
agar benar-benar larut.
3. Media NA kemudian disterilkan pada suhu 121 derajat
celcius selama kurang lebih 20 menit
4. Media NA yang sudah steril dituang ke dalam cawan Petri
kurang lebih 11 mL dan dibiarkan hingga memadat.
d. Uji plak (Plaque assay test)
Alat dan bahan :
- Erlenmeyer berisi 10 mL media NB
- Tabung mikro 1.5 mL
- Pipet mikro (1000 uL dan 200 uL) dan tip
- Soft agar bersuhu 40 derajat celcius
- Media NA kurang lebih 11 mL di dalam cawan Petri
- 0.85% NaCl fisiologis

Langkah kerja :

1. Isolat murni bakteri inang ditumbuhkan di dalam 10 mL

media NB, inkubasi 24 jam, pada suhu 37 derajat celcius.
Kondisi optimal kultur yang akan digunakan untuk isolasi
faga adalah sel bakteri pada fase eksponensial.
2. Sebanyak 100 uL supernatan faga hasil enrichment
dimasukkan ke dalam tabung mikro steril yang berisi 900 uL
NaCl fisiologis, selanjutnya dibuat pengenceran berseri dari
10-1 sampai 10-8.
3. Setiap seri pengenceran supernatan faga diambil sebanyak
100 uL, lalu dimasukkan ke dalam tabung mikro steril dan
ditambah 100 uL kultur bakteri inang pada masing-masing
tabung mikro. Selanjutnya, diinkubasi pada suhu 37 derajat
celcius selama 30 menit.
4. Setelah inkubasi, sebanyak 200 uL campuran kultur bakteri
dan faga tersebut dimasukkan ke dalam media soft agar yang
 5

bersuhu 40 derajat celcius lalu dihomogenkan dengan

menggunakan vorteks.
5. Soft agar yang sudah mengandung campuran faga dan
bakteri inang, kemudian dituang sampai merata di atas media
NA dalam cawan Petri.
6. Soft agar dibiarkan hingga padat, kemudian diinkubasi pada
suhu 37 derajat celcius selama 18-24 jam.
7. Ada tidaknya plak pada cawan tersebut diamati setelah masa
inkubasi. Adanya plak menunjukkan bahwa sampel positif
mengandung faga yang mampu melisiskan bakteri inang.

2. Kuantifikasi Bakteriofaga (Double Layer)

Tujuan : Untuk menghitung jumlak plak yang telah terbentuk dalam cawan petri
dengan satuan Plaqua Forming Unit (PFU).
Metode : Konsentrasi Faga (PFU/mL) = Jumlah plak x 10 x kebalikan faktor
pengenceran
Contoh: Plak pada cawan agar yang dapat dihitung adalah dari stok faga hasil
pengenceran 10-6. Jumlah plak pada pengenceran tersebut 54, maka:
Konsentrasi faga = jumlah plak x 10 x kebalikan faktor pengenceran
= 54 x 10 x 10 pangkat 6
= 5.4 x 10 pangkat 8 PFU/mL

D. Purifikasi dan Penyimpanan Bakteriofaga

1. Purifikasi Bakteriofaga
Tujuan : Untuk memurnikan faga
Alat dan bahan :
- Pipet Pasteur
- Tabung Falkon
- Membran filter 0.22 um
- Cawan agar yang mengandung plak
- Bufer SM
 6

Langkah kerja :

a. Plak dipindahkan dengan menggunakan pipet Pasteur ke dalam

tabung falkon steril, kemudian dicampurkan dengan 2-3 mL bufer
SM.
b. Suspensi faga dihomogenkan menggunakan vorteks, selanjutnya
diinkubasi pada suhu ruang selama 5-10 menit.
c. Selanjutnya, disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 20
menit untuk memisahkan supernatan faga dengan pelet bakteri.
d. Proses berikutnya adalah filtrasi supernatan faga dengan
menggunakan membran filter 0.22 um, dan filtrat dimasukkan dalam
tabung steril sehingga diperoleh cairan faga murni.
e. Cairan faga murni disimpan pada suhu 4 derajat celcius.

2. Penyimpanan Bakteriofaga
Tujuan : Untuk menyimpan bakteriofaga
Metode : Bekteriofaga disimpan dengan cara isolat discrubbing, dimasukkan ke
dalam tabung eppendorf yang sebelumnya telah diisi larutan PBS sebanyak 1 ml
dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil
dan ditambahkan dengan klorofom sebanyak 1 tetes per 1 ml PBS. Tabung disimpan
pada suhu 4 derajat celcius.

E. Penentuan Kisaran Inang Bakteriofaga

Tujuan : Untuk mengetahui spesifitas dan kisaran inang fag luas atau sempit
Alat dan bahan :
- Tabung mikro 1.5 mL
- Mikropipet (1000 uL dan 200 uL) beserta tip
- Media soft agar 0.8%
- Media Nutrient Agar
- Media Nutrient Broth
- NaCl fisiologis 0.85%
- Stok cairan fag
- Kultur bakteri inang (patogen)
- Kultur bakteri nonpatogen
 7

Langkah kerja :

a. Kultur bakteri inang dan kultur E. coli non patogen pada media NB
disiapkan terlebih dahulu dan diinkubasi pada suhu 37 derajat
celcius selama 24 jam.
b. Stof faga diencerkan menggunakan NaCl fisiologis dengan metode
pengenceran berseri dari 10-1 sampai 10-7
c. Stof faga dari 3 seri pengenceran terakhir diambil masing-masing
sebanyak 100 uL, kemudian dicampur dengan 100 uL kultur bakteri
inang, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 derajat
celcius. Langkah kerja yang sama juga dilakukan untuk campuran
faga dengan kultur E. coli non patogen.
d. Setelah inkubasi, campuran kultur bakteri dengan faga dimasukkan
ke dalam soft agar yang masih bersuhu 40 derajat celcius, dan
dihomogenkan dengan menggunakan vorteks.
e. Soft agar tersebut dituang hingga merata di atas media cawan agar.
Setelah soft agar memadat, kemudian diinkubasi pada suhu 37
derajat celcius selama 18-24 jam.
f. Apabila pada media cawan agar terbentuk plak, artinya faga tersebut
dapat melisiskan bakteri inang.