EKSTRAKSI PROTEIN

INTRASELULAR
PERCOBAAN

TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat mengetahui dan
mampu melakukan ekstraksi protein
intraselular

ALAT DAN BAHAN

Alat :
Mikropipet
Tip biru
Eppendorf
Sentrifuge dingin
Inkubator goyang
Ultrasonik
Homogenizer
Bahan :

Dibiakkan bakteri tunggal E-coli dalam 10 ml media LB dan

inkubasi selama 18 jam suhu 37oC dalam inkubator goyang dengan
kecepatan 150 rpm (dilakukan sehari sebelumnya)

PROSEDUR KERJA

Dimasukkan biakan bakteri ke dalam tabung eppendorf 1,5

ml dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan
12.000 rpm

Diulangi prosedur diatas hingga biakan bakteri habis untuk

mendapatkan pellet sel bakteri

Diresuspensi pellet bakteri dengan larutan PBS pH 7,4

hingga sempurna

Dilisis sel dengan sonikasi menggunakan frekuensi 2,5 3 hz selama

30 detik

Dihentikan selama 30 detik selanjutnya di sonikasi lagi selama 30

detik sehingga sel pecah

Dilakukan selama 10 kali dalam suhu dingin

Dipindahkan suspense protein ke dalam tabung eppendorf

dan disentrifugase pada 10.000 rpm selama 5 menit pada
suhu 4oC

Dikumpulkan supernatant untuk proses selanjutnya

PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan
percobaan ekstraksi protein intraseluler. Isolasi protein
ini dari bakteri E.coli. Isolasi protein bertujuan untuk
memisahkan protein dari makromolekul lain atau
memisahkan protein dengan sifat tertentu dan protein
dari protein lain yang tidak diinginkan dalam analisa.
Mula mula dilakukan penanaman bakteri yang
dilakukan sehari sebelum praktikum selama 18 jam.
Penanaman koloni tunggal bakteri E.coli dilakukan
dalam 10 mg media LB cair dari media LB padat dan
di inkubasi selama 18 jam pada suhu 37oC dengan
inkubator goyang pada kecepatan 150 rpm.

Pada saat praktikum, praktikan melakukan

pemanenan bakteri dari media LB cair yang
telah
dilakukan
pada
hari
sebelumnya.
Pemanenan
dilakukan
dengan
cara
memasukkan biakan ke dalam mikrotube
sebanyak tiga mikrotube. Lalu, setelah itu di
sentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan
12.000 rpm. Setelah itu, supernatant dibuang
dan didapatkan pellet sel bakteri. Pelet tersebut
dijadikan satu, langkah ini dilakukan sampai
semua biakan bakteri dalam media habis.

Setelah dilakukan pemanenan, pellet

sel bakteri di resuspensi dengan
menggunakan larutan PBS pH 7,4.
Larutan yang digunakan sebanyak 1 ml
untuk ketiga mikrotube. Diresuspensi
hingga sempurna. Lalu, dijadikan satu
pada tabung untuk sonikasi atau tabung
sentrifuge.

Selanjutnya, bakteri di lisiskan menggunakan metode

sonikasi. Terdapat 2 cara untuk memecah atau
melisis sel yaitu secara mekanik dengan sonikasi
dan secara kimia dengan menambahkan zat kimia
tertentu
(DTT)
ataupun
enzim
(lisozim).Pada
praktikum ini dilakukan dengan metode sonikasi,
Sonikasi dilakukan pada
frekuensi 2,5 3 hz
selama 30 detik, kemudian diberi jeda berhenti
selama 10 detik, dan dilanjutkan sonikasi kembali
selama 30 detik. Langkah tersebut dilakukan secara
berulang sebanyak 10 kali pada suhu dingin dan
menggunakan alat yaitu sonic raptor.

Setelah itu, suspensi yang mengandung

protein setelah disonikasi dipindahkan ke
dalam mikrotube dan disentrifuge kembali
pada kecepatan 10.000 rpm selama 5
menit pada suhu 4oC.
Supernatan yang dihasilkan kemudian
dipindahkan ke dalam mikrotube baru dan
kemudian mikrotube yang berisi protein
disimpan
dalam
suhu
-20oC
untuk
digunakan pada analisis selanjutnya.

KESIMPULAN
Penanaman dari bakteri E.coli diperoleh
hasil yang baik karena tidak terjadi
adanya kontaminan pada bakteri.
Ekstraksi protein intraseluler dikatakan
berhasil apabila setelah di elektroforesis
terbentuk pita.
Diperoleh hasil berupa pelet sel ,yang
digunakan untuk analisis selanjutnya dan

DAFTAR PUSTAKA

Cappette, DR. 2005. Measuring

Rlative Motility of Protein Bonds.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi
Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit
Koniskus.

ELEKTROFORESIS
PROTEIN

Alat dan Bahan

Alat :
1.
Alat Elekroforesis Protein
2.
Vial
3.
Mikropipet
4.
Mikrotube
5.
Tip
Bahan :
.Aquadest
.Separating Buffer
.Stacking Buffer
.SDS 10%
.Acrylamid-bisacrylamide 30%
.TEMED

APS 10%
Larutan staining
Larutan destaining
Glisin
Marka protein
Protein hasil isolasi

CARA KERJA
Pembuatan Gel SDS-PAGE
Kaca untuk pencetak gel dipasang pada alat cetakan

Alat cetakan di tes kebocoran dengan memasukkan aquades

diantara kedua kaca dan dibiarkan beberapa saat. Apabila tidak
bocor, air dibuang dan dibersihkan dengan menyerapnya
menggunakan tissue

Disiapkan separating gel 12% (b/v) dan stacking gel 4 % sebanyak 5 ml

dengan komposisi sebagai berikut :

Bahan
Aquadest

Separating gel
12%
1975 L

Stacking Gel 4%
1380 L

Separating Buffer (1,5 M Tris HCl 938 L

pH 8,8)
Stacking Buffer (0,5 M TrisHCl
pH 6,8)
10% SDS
50 L

30% Acrylamid-bisacrylamide

2 mL

335 L

TEMED

50 L

2,5 L

10% APS

5 L

15 L

250 L
20 L

Separating gel dibuat dengan mencampurkan seluruh bahan diatas dimana APS 10% dan
TEMED dimasukkan paling akhir. Campuran dihomogenkan dengan memipet naik turun
secara perlahan dan larutan harus segera dituang ke alat cetakan.
Separating gel dimasukkan ke cetakan hingga mencapai garis batas warna hijau (sekitar 0,5
mm dari ujung sisir pencetak sumur gel pada stacking gel)
Segera dimasukkan aquadest dibagian atas separating gel untuk mendapatkan permukaan
yang rata
Separating gel didiamkan hinga memadat (sekitar 30 menit), setelah memadat aquadest
dibuang
Stacking gel dibuat seperti komposisi diatas dan APS 10% dan TEMED dimasukkan paling
akhir dan dihomogenkan dengan memipet naik-turun
Setelah homogen segera masukkan kedalam cetakan hingga penuh
Sisir pencetak sumur kemudian diselipkan pada stacking gel secara hati-hati
Stacking gel didiamkan hingga memadat (15 menit) dan sisir pencetak sumur diambil

 Pembuatan Dapar Elektroforesis

Timbang 3 g tris, 14,4 g glisin dan1 g
SDS
Larutkan dengan aquades hingga 1 liter

 Proses Elektroforesis
Protein hasil overproduksi sebanyak 20 L ditambah dengan 5 L loading dapar 5x dan
diapanskan pada suhu 90-95oC selama 5-10 menit

Marka protein masukkan ke dalam sumur gel sebanyak 10 L

Protein-protein tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel sesuai dengan kode yang telah
ditentukan
Running sampai batas atau 1 jam dengan kondisi 60 volt
Keluarkan gel dari alat, rendam dalam larutan staining sampai terlihat pita (30 menit )

Ambil gel dan pindahkan ke dalam kotak destaining, biarkan selama semalam atau
hingga pita protein dapat terlihat dengan jelas
Amati pita protein yang terbentuk, kemudian dibandingkan dengan pita protein marka
untuk menentukan berat molekulnya

HASIL PENGAMATAN
Data hasil elektroforesis protein

Marka
protein

Sampel
A4

PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini kami melakukan elektroforesis
protein yang merupakan ekstrak protein dari
praktikum sebelumnya. Hasil elektroforesis protein
didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan
berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita
yang terbentuk dari pita protein menunjukkan
kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai
berat molekul yangsama yang berada pada posisi pita
yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip
pergerakanmolekul bermuatan, yakni molekul
bermuatan dapat bergerak bebas di bawah
pengaruhmedan listrik, molekul dengan muatan dan
ukuran yang sama akan terakumulasi padazona atau
pita yang sama atau berdekatan.

 Marka yang digunakan dalam praktikum kali ini

adalah SeBlue LC5625