Protokol Cell Surface Staining Flowcytometri Annexine V/Pi :

1. Semua Reagen diletakkan di suhu ruangan sebelum digunakan

2. Pelet sel dicuci dengan Flow Cytometry/Cell Staining Buffer (jumlah sel 2x105 → dari 2
well Negative Control/NC )
3. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 2500 rpm, selama 3 menit dan pada suhu 4⁰C
4. Supernatan dibuang dan pelet sel yang ada di bagian dasar siap untuk distaining
dengan cell surface marker Ab
(NOTE : permintaan peneliti untuk supernatan tetap disimpan dalam ependoff terpisah)
5. Ambil 50uL suspense sel dan letakkan pada ependof 1,5 ml
6. Dibuat terlebih dahulu larutan enceran campuran dari marker-marker yang akan
diperiksa (dalam 50 μL Flow Cytometry Staining Buffer) :

- Buat larutan Surface Antibodi dengan menambahkan 5µl Annexin dan 5µl Pi pada
50µl cell staining buffer (untuk tiap sampel)

7. Staining dengan mencampurkan semua no.6 ke suspense sel. Kemudian dihomogenkan

dengan cara dipipetting.
8. Pelet sel yang telah diberi antibodi diinkubasi dalam cooling box, selama 20 menit dalam
gelap.
9. Setelah inkubasi selesai ditambahkan 500 μL Flow Cytometry/Staining Buffer dan
dihomogenkan kembali dengan cara divortex/dipipetting
10. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 2500 rpm, selama 3 menit dan pada suhu 4⁰C
11. Supernatan dibuang
12. Pellet ditambah dengan fixation buffer 500 μL. Dihomogenkan dengan pipetting /
vortex
13. Diinkubasi dalam suhu dingin 4⁰C atau cooling box selama 20 menit dalam gelap
14. Kemudian disentrifus lagi dengan kecepatan 2500 rpm, selama 3 menit dan pada suhu
4⁰C
15. Supernatan dibuang. Pellet dicuci dengan Staining buffer 1 mililiter → pipetting/vortex
16. Disentrifus lagi dengan kecepatan 2500 rpm, selama 3 menit dan pada suhu 4⁰C
17. Supernatan dibuang. Pellet ditambah dengan Staining buffer 300 μL
18. Bahan siap dibaca dengan flowcytometry → dibawa ke Malang dalam cooling box