Pengambilan Sampel

Pengambilan Sampel 1.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: spuit 1 cc, spuit 3 cc, vortex, sentrifugator, mikropipet, ependorf, kasa steril, mikroplate V, penangas air, mikroskop, dan kertas saring 1.2 Bahan Bahan yang digunakan antara lain: kuning telur ayam, darah mencit Balb/c, antigen OMP 237 kDa, sel enterosit mencit Balb/c, complete Freuds adjuvant, incomplete Freuds adjuvant, buffer A, PEG 6000, larutan PBS pH 7,4, H2O, dan cat gram (safranin). 1.3 Cara Pengambilan Sampel Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini yakni mencit Balb/c dan ayam petelur jenis Lohman. Mencit selanjutnya diambil darahnya melalui vena jantung untuk dilakukan uji hambat hemaglutinasi, sementara itu bagian sel enterosit yang berasal dari usus mencit diisolasi untuk dilakukan uji hambat adhesi. Sedangkan ayam petelur jenis Lohman digunakan sebagai media penghasil antibodi poliklonal IgY yang berasal dari kuning telur melalui induksi antigen pili Shigella dysenteriae. Metode isolasi antibodi poliklonal dan eritrosit mencit diuraikan sebagai berikut. a. Metode Isolasi Antibodi Poliklonal dari Kuning Telur Sebelum imunisasi dua butir telur pertama diambil untuk isolasi antibodi preimun sebagai kontrol negatif. Imunisasi dilakukan dengan

menyuntikkan 30 l antigen OMP 237 kDa Shigella dysentriae secara subkutan pada sayap ayam bagian bawah. Suntikan yang pertama dicampur dengan complete Freuds adjuvant. Suntikan yang kedua dan selanjutnya dicampur incomplete Freuds adjuvant dengan selang waktu satu minggu. Telur dipanen setelah disuntikkan bosster yang kedua pada hari kelima sampai hari ke tujuh belas. Isolasi antibodi IgY diambil dari

kuning telur dengan cara memisahkan kuning telur dengan bagian yang putih. Kuning telur disuspensikan dengan buffer A yang mengandung 0,1g KCl, 4g NaCl, 0,12g KH2PO4 dan 0,72 g Na2HPO4 dengan perbandingan volume 1:9 (kuning telur: buffer). Kemudian dicampur dengan larutan prophylene ethylene glycol 6000 (PEG) dengan konsentrasi 3,5%, suspensi disentrifugasi 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4o C. Supernatan diambil dan disaring dengan kasa steril kemudian ditambahkan PEG 6000 sampai dengan konsentrasi 8% dan diaduk sampai seluruh PEG larut. Larutan disentrifugasi 14000 rpm selama 10 menit pada suhu 4o C. Pelet yang mengandung Imunoglobulin G Yolk Sac (IgY) disuspensi dengan buffer A lalu ditambahkan PEG 6000 sampai konsentrasi 24%. Suspensi disentrifugasi 14.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4o C. Pellet dilarutkan dalam buffer A 10 ml dan dilakukan dialisis semalam. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4o C untuk menghilangkan kotoran. Supernatan disimpan pada suhu -20o C dan disiapkan untuk penelitian selanjutnya. Antigen yang dipakai adalah protein adhesi OMP dengan berat molekul 237 kDa

b.

Metode Isolasi Eritrosit Mencit Balb/c

Mencit yang dipakai adalah mencit sehat usia 1 bulan dengan berat kirakira 50-100 gram. Sebelum mengambil darah, mencit terlebih dahulu dibius dengan menggunakan eter. Darah mencit diambil melalui vena jantung menggunakan spuit insulin. Selanjutnya, darah yang sudah diambil dimasukkan dalam tabung sentrifugasi yang berisi EDTA. Tabung digoyangkan secara perlahan sampai homogen, kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang didapatkan dari hasil sentrifugasi kemudian dibuang. Sementara pellet yang dihasilkan akan ditambahkan 2 ml PBS pH 7,4 kemudian disentrifugasi lagi. Langkah ini dilakukan 3 kali sehingga diperoleh eritrosit murni. Selanjutnya pellet diambil sebanyak 50 l dengan pipet mikro dan ditambahkan 10 ml PBS pH 7,4 secara bersamaan ke dalam

cawan petri steril. Cawan petri digoyangkan secara perlahan sampai homogen, dan eritrosit murni siap digunakan.

c. Metode Isolasi Sel Enterosit Mencit Balb/c Mencit Balb/c yang digunakan berusia 1 bulan dengan berat kira-kira 50100 gram. Mencit Balb/c dianestesi dengan eter , kemudian diambil bagian usus halusnya. Jaringan usus halus kemudian dipotong dengan ukuran 5 cm setiap potongan dimana sebelumnya dilakukan pembukaan lumen usus dengan cara memotong melintang. Usus dicuci dengan PBS pH 7,4 yang mengandung 1 mM dithiothretinol pada suhu 4o C sampai tampak bersih. Selanjutnya, usus halus dimasukkan dalam cairan yang mengandung 1,5mM KCl, 9,6 mM NaCl, 27 mM Natrium Sitrat, 8 mM KH2PO4 dan 5,6 mM Na2HPO4 dengan pH 7,3. Setelah itu, jaringan diinkubasi pada shaking incubator selama 15 menit dengan suhu 37o C. Setelah waktu tersebut terlampaui, maka supernatan dibuang dan jaringan dipindahkan dalam cairan PBS pH 7,4 yang mengandung 1,5 mM EDTA dan 0,5 mM dithiothretinol. Campuran ini selanjutnya disentrifuge selama 10 menit pada dengan kecepatan 6000 rpm dan diulang sebanyak 3 kali. Supernatan dibuang dan jaringan dicuci dengan PBS, kemudian disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm, dan diulang sebanyak 3 kali. Setelah waktu pencucian cukup, maka jaringan usus disuspensikan dalam cairan PBS pH 7,4.