Analisis Escherichia coli berdasarkan FDA/BAM

MAKALAH MIKROBIOLOGI

Oleh :
Kenny Nurmalia Brilliani

(110114366)

Mutiara Shinta Devi Gusti Leona

(110114369)

Ni Luh Putu Evayanti

(110114371)

Andhika Lamindo Kaban

(110114380)

F-4

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SURABAYA

SURABAYA
Mei 2016
1

DAFTAR ISI
Cover ................................................................................................................ 1
Daftar Isi .......................................................................................................... 2
Pendahuluan ..................................................................................................... 3
Metode Kerja ................................................................................................... 4
Pembahasan ..................................................................................................... 5
Kesimpulan ...................................................................................................... 14
Daftar Pustaka .................................................................................................. 15

PENDAHULUAN
Eschericia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk batang, tebal 0,5
m, panjang antara 1,0-3,0 m, tidak membentuk spora dan merupakan flora
normal di usus. Beberapa sifat E. coli antara lain pertumbuhan optimum pada
suhu 37oC, dapat tumbuh pada suhu 15oC-45oC, tumbuh baik pada pH 7,0 tapi
tumbuh juga pada pH yang lebih tinggi. E. coli berfungsi untuk menekan
pertumbuhan bakteri jahat, dia juga membantu dalam proses pencernaan termasuk
pembusukan sisa-sisa makanan dalam usus besar. Fungsi lain dari E. coli adalah
membantu proses pembentukan vitamin K yang berfungsi untuk pembekuan
darah.
Beberapa jenis E. coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe yang
masuk dalam golongan E. coli Enteropatogenik, E. coli Enteroinfasif, E. coli
Enterotoksigenik dan E. coli Enterohemoragik. E. coli 0157 adalah jenis yang
bisa membahayakan tubuh, seperti mengakibatkan diare bercampur darah, kram
perut, dan muntah-muntah dan apabila bakteri ini menjalar ke siste/organ tubuh
yang lain dapat menginfeksi. Seperti pada saluran kencing, jika bakteri E. coli
sampai masuk saluran kencing dapat mengakibatkan infeksi saluran kemih (ISK),
umunya terjadi pada perilaku sex yang salah (anal sex) juga resiko tinggi bagi
wanita karena posisi anus dan saluran kencingnya berdekatan sehingga
kemungkinan bakteri menyebrang cukup besar tepatnya ketika membersihkan
anus setelah buang air besar.
Berbagai cara pengujian E. coli telah dikembangkan, tetapi analisis
konvensional yang masih banyak dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis
yang memerlukan waktu 5-7 hari. Empat analisis tersebut adalah uji pendugaan
dengan metode MPN (Most Probable Number), uji penguat pada media selektif,
uji lengkap dengan media lactose broth, serta uji identifikasi dengan melakukan
reaksi IMViC (indol, methyl red, Vogues-Praskauer, dan citrat). E. coli
menghasilkan asam dan gas dari glukosa, laktosa, fruktosa, maltosa, arabinosa,
dan manitol. E. coli menghasilkan katalase, tidak mencairkan gelatin, membentuk
indol, mereduksi nitrat, tidak menghasilkan gas H2S.

METODE KERJA

25 g sampel dicampur di

Homogenkan selam

Diencerkan 10-2 dengan dilarutka

Dipipet 1 ml dari tiap

Diinkubasi 48 jam 2 jam

Tab

BLGB broth + tabung du

Diinkubasi 48 jam 2 jam pada s

Ditentukan nilai MPN seb

Tabung EC
Diinkubasi 24 jam 2 jam
5

Diinkubasi 24 jam 2 jam

Diinterpretasikan hasil, dinyatakan

PEMBAHASAN
Berbagai cara pengujian E. coli telah dikembangkan, tetapi analisis
konvensional yang masih banyak dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis
yaitu uji Pendugaan dengan metode MPN ( most probable number ), Uji penguat
pada medium selektif, Uji lengkap dengan medium lactose broth, serta Uji
Identifikasi dengan melakukan reaksi IMViC (indol, methyl red, VoguesPraskauer, dan citrate). Jadi untuk dapat menyimpulkan E. coli berada pada air
atau makanan diperlukan seluruh tahapan pengujian di atas. Apabila dikehendaki
untuk mengetahui serotipe dari E. coli yang diperoleh untuk memastikan apakah
E.coli tersebut patogen atau bukan maka dapat dilakukan uji serologi. Meskipun
demikian, beberapa serotipe patogen tertentu seperti O157:H7 yang ganas tidak
dapat diuji langsung dengan pengujian 4 tahap ini dan memerlukan pendekatan
analisis khusus sejak awal.
1. Tahap pembuatan sampel
Ditimbang sampel, jika berupa padatan sebanyak 25 g atau sampel
berupa cairan sebanyak 25 ml dari sampel yang akan diuji, kemudian
dimasukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 225 ml larutan
BFP. Homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan
pengenceran 10-1. Larutan Butterfields phosphate buffered (BFP)/Larutan
KH2PO4 adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan. Pengenceran dilakukan
untuk memperoleh sampel dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu
antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10,
1:100, 1:1000, dan seterusnya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan
bakteri yang ditanam. Seperti halnya media, larutan yang digunakan untuk
mengencerkan sampel biasanya mengandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion
dari mikroba. Buffer yang digunakan untuk pembuatan media dan larutan pengencer
adalah fosfat. Pengunaan fosfat dikarenakan satu-satunya komponen anorganik yang
mengandung sifat buffer pada kisaran pH normal, yaitu merupakan pH yang dapat
mempertahankan keseimbangan fisiologi dari mikroba. Garam fosfat yang sering
digunakan sebagai buffer adalah kalium monohidrogen fosfat atau kalium hidrogen
fosfat. Larutan pengencer ditempatkan dalam tabung reaksi adalah 9 ml setiap tabung

nya.

2. Tahap pendugaan coliform (Presumptive coliform)

Pada uji pendugaan dilakukan dengan menginkubasi sampel yang
telah dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi medium Lauryl dan
tabung durham yang sebelumnya telah dilakukan pengenceran 10-2 dengan cara
melarutkan 1 ml larutan 10-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer BFP. Pada setiap
pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Selanjutnya pindahkan
dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap
pengenceran ke dalam 3 seri tabung Lauryl Tryptose Broth (LTB) yang berisi
tabung durham. Lauryl merupakan media selektif yang digunakan dalam uji
pendugaan Coliform karena dalam Lauryl terdapat laktosa yang menyediakan
sumber karbohidrat yang dapat difermentasi oleh organisme Coliform. Fungsi
dari tabung durham adalah untuk mengetahui terbentuknya gas gelembung atau
untuk menangkap gas yang ditimbulkan akibat adanya fermentasi laktosa
menjadi asam dan gas. Tabung-tabung tersebut selanjutnya diinkubasi selama
48 jam 2 jam pada suhu 35oC 1oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah
inkubasi 24 jam dan inkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24
jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
3. Uji penegasan coliform (confirmed coliform)
Uji penegasan ini berfungsi untuk meyakinkan hasil positif yang ada
pada uji pendugaan yaitu dilakukan dengan cara tabung-tabung LTB yang
positif diinokulasikan ke tabung-tabung BGLB Broth yang berisi tabung
durham dengan menggunakan jarum ose. Medium Brilliant Green Lactase Bile
Broth (BGLBB) yaitu media yang akan berwarna hijau metalik jika terdapat
reaksi fermentasi dengan sampel. Warna ini berasal dari adanya koloni
Coliform yang bereaksi dengan BGLBB. E. coli merupakan bakteri fermentasi,
seringkali menghasilkan warna hijau metalik mengkilap. Penggunaan BGLBB
berfungsi sebagai penghambat pertumbuhan flora mikroba yang tidak
diharapkan dan untuk mendeteksi bakteri Coliform yang ada pada sampel.
Bakteri yang menfermentasi dengan lambat akan menghasilkan koloni
berwarna merah muda. Inkubasi BGLB Broth yang telah diinokulasi selama 48
jam 2 jam pada suhu 35oC 1oC. Periksa tabung-tabung BGLB yang
menghasilkan gas selama 48 jam 2 jam pada suhu 35 oC 1oC. Tabung positif

ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

4. Uji pendugaan E. coli (faecal coliform, presumptive Escherichia coli)
Tahap selanjutnya adalah diinokulasikan dari setiap tabung LTB yang
positif ke tabung-tabung EC Broth yang berisi tabung durham dengan
menggunakan jarum ose, Inkubasi EC Broth dalam waterbath selama 48 jam
2 jam pada suhu 45oC 0,5oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di
dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang
akan diinkubasi. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam
tabung durham. Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM)
berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan
Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai APM/g
faecal coliform
5. Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia coli)
Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan
jarum ose gores ke LEMB agar. LEMB adalah media selektif dan Media
diferensial. Media ini mengandung Eosin dan metilen biru, yang menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif, maka media ini dipilih untuk bakteri Gram
negatif. LEMB juga mengandung karbohidrat laktosa, dengan adanya
karbohidrat laktosa bakteri Gram negatif terdiferensiasi berdasarkan pada
kemampuan mereka untuk memfermentasi laktosa. Warna media sebelum
pemupukan bakteri berwarna merah keunguan. Perubahan warna hijau metalik
pada media LEMB karena Escherichia coli dapat memfermentasi laktosa yang
mengakibatkan peningkatan kadar asam dalam media. Kadar asam yang tinggi
dapat mengendapkan Methylen blue dalam media EMBA. Selanjutnya
dilakukan inkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35 oC + 1oC. Koloni E.
coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian
tengah dengan atau tanpa hijau metalik. Ambil lebih dari satu koloni (typical)
E. coli dari masing-masing cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring
dengan menggunakan jarum tanam. PCA digunakan sebagai medium untuk
mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan
melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose,
agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L. Media PCA ini baik untuk
pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya
mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam
8

amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai
vitamin B kompleks. Inkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35 oC+ 1oC.
jika koloni yang khas (typical ) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang
tidak khas (typical) E. coli ke media PCA miring. Selanjutnya tentukan nilai
angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung BGLB
yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM).
Nyatakan nilainya sebagai APM/g coliform
6. Uji morfologi
Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap
koloni E. coli terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama
24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri E. coli termasuk bakteri
gram negatif, berbentuk batang pendek. Dengan adanya pengaturan
peptidoglikan, sel bakteri dapat dikelompokkan berdasarkan mekanisme
pewarnaan. Mekanisme ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel bakteri
garm negatif dan gram positif serta bagaimana reaksinya terhadap beragam
reagen. Kristal violet, pewarna utama, mewarnai ungu baik bakteri gram
positif dan gram negative dikarenakan pewarna ini memasuki sitoplasma kedua
tipe sel ini. Ketika Iodin (Mordant) di aplikasikan, menyebabkan kristal
violet-iodin sulit melewati dinding sel. Aplikasi alcohol dapat mendehidrasi
peptidoglikan sel gram positif sehingga menyebabkan impermeable terhadap
kristal violet-iodin. Sedangkan pengaruh bagi sel gram negative berbeda,
dimana alcohol melarutkan membrane luar sel gram negative dan
menghasilkan lubang kecil pada lapisan tipis peptidoglikan sehingga kristal
violet-iodin menyebar/ keluar. Karena bakteri gram negative kehilangan warna
setelah pencucuian dengan alcohol, penambahan safranin menjadikan sel
merah muda. Safranin memberikan warna kontras terhadap pewarna utama
(kristal violet). Walaupun sel gram positif dan gram negative dapat menyerap
safranin, warnah merah muda safranin tertutupi oleh ungu gelap yang diserap
sebelumnya oleh bakteri gram positif.
7. Uji biokimia
Produksi indol ( I )
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone Broth lalu
diinkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35oC 1oC. Uji Indol dilakukan
dengan menambahkan 0,2 ml 0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika

terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila
terbentuk cincin warna kuning. Tryptophan merupakan asam amino esensial
yang dapat mengalami oksidasi dengan cara kegiatan enzimatik beberapa
bakteri. Konversi triptofan menjadi produk metabolik di mediasi oleh enzim
Tryptophanase. Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat.
Perbenihan indol digunakan untuk melihat kemampuan bakteri mendegradasi
asam amino triptofan secara enzimatik. Hasil uji indol yang diperoleh negatif
karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan
biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai
sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks.
Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat
pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh
mikroorganisme akibat penguraian protein.

Uji voges proskauer (VP)

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam MRVP Broth. Inkubasi
selama 48 jam 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari
setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm
steril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpha naphtol dan 0,2 ml 40 % KOH,
kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok
kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah
muda eosin sampai merah mirah delima (ruby). VP adalah tes yang digunakan
untuk mendeteksi acetoin dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan
dengan menambahkan alpha-naftol dan kalium hidroksida dengan kaldu Voges
Proskauer yang telah diinokulasi dengan bakteri. Warna merah cherry
menunjukkan hasil yang positif, sedangkan warna kuning-coklat menunjukkan
hasil

negatif.

Tes

ini

tergantung

pada

pencernaan

glukosa

menjadi

acetylmethylcarbinol. Jika glukosa pecah, maka akan bereaksi dengan alpha-

10

naftol (VP reagen 1) dan kalium hidroksida (VP reagen 2) untuk membentuk
warna merah. Alpha-naftol dan kalium hidroksida adalah bahan kimia yang
mendeteksi acetoin. Asetil-metil carbinol (acetoin) adalah perantara dalam
produksi butilen glikol. Dalam tes ini dua reagen, 40% KOH dan alpha-naftol
ditambahkan setelah inkubasi dan terkena oksigen. Jika terdapat acetoin, acetoin
akan teroksidasi dengan adanya udara dan KOH menjadi diacetyl. Diacetyl
kemudian bereaksi dengan komponen guanidin dari pepton, adanya alpha-naftol
menghasilkan warna merah. Peran alpha-naftol adalah untuk katalis dan penguat
warna.

Uji methyl red (MR)

Inkubasikan kembali MRVP Broth di atas selama 48 jam 2 jam pada
suhu 35oC +1oC. Tambahkan 5 tetes indikator Methyl red pada setiap MRVP
Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk
warna kuning. Uji MR dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi
merah setelah ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan
asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang
terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media
akan menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator
metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH serendah itu maka
indikator tersebut menjadi merah. Jika hasil berwarna kuning menunjukkan
hasil negatif (pH 6,0). Hal ini menandakan bahwa bakteri ini bukan bakteri
peragi asam campuran.

11

Uji sitrat (C)

Tes Citrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk
memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Goreskan 1

ose dari PCA miring ke permukaan simmon citrat agar yang mengandung
natrium sitrat dan indikator pH Bromthymol biru selanutnya dinkubasi selama
96 jam + 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Media juga mengandung garam amonium
anorganik, yang digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan
sitrat melibatkan enzim citrat permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat
dan asetat. Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO 2. Produksi
Na2CO3 serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masingmasing menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium
dari hijau menjadi biru., reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media

tetap hijau.

Produksi gas dari laktosa

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring kedalam LTB. Inkubasi selama 48
jam 2 jam pada suhu 35oC +1oC .reaksi positif jika menghasilkan gas pada
tabung durham.
8. Interpretasi Hasil
Tabel 1. Interpretasi hasil
Kriteria

Biotipe 1

Biotipe 2

Gas pada tabung LTB

Indol

MR

12

VP

Citrat

Gram negatif, bentuk batang

Gram negatif, bentuk batang

pendek tidak berspora

pendek tidak berspora

Uji Morfologi

Pelaporan
Berdasarkan interpretasi hasil di atas, nyatakan coliform dan Escherichia coli
dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM).
Tabel 2. Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai
kombinasi hasil positif dari 3 seri tabung pada pengenceran 101, 102 dan 103
Tingkat
kepercayaan

Tabung positif

Tabung positif APM/g

Tingkat
kepercayaan

APM/g
101 102

103

Bawah

Atas

101

102

103

Bawah

Atas

<3,0

9,5

21

4,5

42

3,0

0,15

9,6

28

8,7

94

3,0

0,15

11

35

8,7

94

6,1

1,2

18

29

8,7

94

6,2

1,2

18

36

8,7

94

9,4

3,6

38

23

4,6

94

3,6

0,17

18

38

8,7

110

7,2

1,3

18

64

17

180

11

3,6

38

43

180

7,4

1,3

20

74

17

200

11

3,6

38

120

37

420

11

3,6

42

160

40

420

13

15

4,5

42

93

18

420

16

4,5

42

150

37

420

9,2

1,4

38

210

40

430

14

3,6

42

290

90

1000

20

4,5

42

240

42

1000

15

3,7

42

460

90

2000

20

4,5

42

1100

180

4100

27

8,7

94

>1100

420

--

SUMBER : Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. 8th edition,
1998

14

KESIMPULAN
Eschericia coli merupakan bakteri gram negatif dan merupakan flora
normal di usus. E. coli berfungsi untuk menekan pertumbuhan bakteri jahat, dan
membantu dalam proses pencernaan termasuk pembusukan sisa-sisa makanan
dalam usus besar. Fungsi lain dari E. coli adalah membantu proses pembentukan
vitamin K yang berfungsi untuk pembekuan darah.
Berbagai cara pengujian E. coli telah dikembangkan, tetapi analisis
konvensional yang masih banyak dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis
yaitu uji Pendugaan dengan metode MPN ( most probable number ), Uji penguat
pada medium selektif, Uji lengkap dengan medium lactose broth, serta Uji
Identifikasi dengan melakukan reaksi IMViC (indol, methyl red, VoguesPraskauer, dan citrate). Keempat tahap uji tersebut termasuk dalam analisa secara
kualitatif. Dimana dalam pengujiannya didapatkan hasil uji yang

15

DAFTAR PUSTAKA

16