PRAKTIKUM V

PENETAPAN BAKTERI KOLIFORM DENGAN

MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

NAMA : DICKY IRAWAN PRANATA

NIM : 15.71.016565

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PALANGKA RAYA

2017

i|MIKROBIOLOGI
 PRAKTIKUM V

PENETAPAN BAKTERI KOLIFORM DENGAN

MOST PROBABLE NUMBER (MPN)
A. Tujuan
a. Untuk mengetahui prinsip metode MPN.
b. Untuk mengetahui fungsi dari media LBSS, LBDS, BGLB.
c. Untuk mengetahui teknik uji kualitas air dengan menggunakan metode
MPN.
d. Untuk memeriksa adanya bakteri Coliform dan Coli tinja pada sampel
minuman.

B. Dasar Teori
Air adalah materi esensial di dalam kehidupan. Air sangat
dibutuhkan oleh makhluk hidup khususnya sebagai air minum, namun air
juga menimbulkan berbagai gangguan kesehatan terhadap si pemakai
khususnya diare. Oleh karena itu, air harus bebas dari pencemaran dan
memenuhi tingkat kualitas tertentu sesuai dengan kebutuhan kadar di
dalam tubuh manusia.
Air merupakan kebutuhan yang paling dibutuhkan di dalam
kehidupan manusia. Air yang ada di alam bukanlah didapat sebagai air
murni, melainkan sebagai air yang mengandung bermacam-macam zat,
baik yang terlarut ataupun tersuspensi. Jenis dan jumlah zat tersebut
tergantung dari kondisi lingkungan sekitar sumbernya.
Air merupakan materi esensial bagi kehidupan makhluk hidup,
karena makhluk hidup memerlukan air untuk mempertahankan
kelangsungan hidupnya. Secara umum fungsi air dalam tubuh setiap
mikroorganisme adalah untuk melarutkan senyawa organik, menstabilkan
suhu tubuh dan melangsungkan berbagai reaksi kimia tingkat seluler.
Pemeriksaan air secara mikrobiologi sangat penting dilakukan
karena air merupakan substansi yang sangat penting dalam menunjang
kehidupan mikroorganisme yang meliputi pemeriksaan secara

1|MIKROBIOLOGI
mikrobiologi baik secara kualitatif maupun kuantitatif dapat dipakai
sebagai pengukuran derajat pencemaran.
Pemerikasaan air secara mikrobiologi sangat penting dilakukan,
karena air merupakan substansi yang penting dalam menunjang kehidupan
mikroorganisme.Pemeriksaan secara mikrobiologi, baik secara kuantitatif
maupun kualitatif dapat dipakai sebagai pengukuran derajat pencemaran.
Penelitian derajat pencemaran air secara mikrobiologi umumnya
ditunjukkan pada kehadiran bakteri indikator (coliform dan fecal
coliform).
Standar Air Minum, menurut standar WHO semua sampel tidak
boleh mengandung E. coli dan sebaiknya juga bebas dari bakteri coliform.
Menurut standar WHO, 95% dari sampel-sampel tidak boleh mengandung
coliform dalam 100 ml, Tidak ada sampel yang mengandung E. coli dalam
100 ml, Tidak ada sampel yang mengandung coliform lebih dari 10 dalam
100 ml, Tidak boleh ada coliform dalam 100 ml dan dua sampel yang
berurutan (AOAC,2000).
Uji kualitatif Coliform secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji
dugaan (presumptive test), uji penetapan (confirmed test), dan uji
pelengkap (completed test). Metode pengujian yang digunakan adalah
metode Most Probable Number (MPN) atau Jumlah Perkiraan Terbatas
(JPT).
Analisis kuantitatif mikrobiologi pada air minum penting dilakukan
untuk mengetahui mutu air minum tersebut. Ada beberapa cara yang dapat
digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik dalam
suatu suspensi, salah satunya adalah pemeriksaan adanya bakteri Coliform
pada minuman dengan metode MPN (Most Probable Number).
Bakteri coliform yang difermentasi dengan media laktosa akan
menghasilkan gas jika diinkubasi selama lebih dari 48 jam pada suhu 35C,
itulah dasar dilakukan metode MPN dengan melihat gas yang dihasilkan
dalam tabung reaksi yang kemudian disesuaikan dengan tabel MPN
Metode MPN terdiri dari 3 langkah, yaitu :

2|MIKROBIOLOGI
1. Uji Penduga (Presumtive test)
Sampel air diletakkan dalam tabung steril yang berisi Lactose
Broth. Beberapa tabung diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35C,
kemudian diperiksa terbentuknya gas, karena bakteri akan
memfermentasikan laktosa dan menghasilkan gas. Jika gas tidak
terbentuk dalam 24 jam, inkubasi diteruskan hingga 48 jam. Tes
penduga dikatakan positif jika pada tabung terdapat gas yang ditandai
dengan terapungnya tabung durham. Uji ini mendeteksi sifat
fermentative coliform dalam sampel dan harus dikonfirmasi dengan tes
konfirmatif untuk menyingkirkan keberadaan organisme lain yang
memberikan hasil positif pada fermentasi laktosa.
2. Uji Penegas (Confirmed test)
Tabung positif yang didapatkan dari uji penduga dilanjutkan
dengan uji penegas. Sampel positif yang menunjukkan gas diinokulasi
pada media Brilian Green Lactose Broth, kemudian inkubasi pada suhu
37C selama 48 jam. Apabila dihasilkan gas, maka uji penegas ini
dinyatakan positif (Willey, 2008).
3. Uji Pelengkap (Complete test)
Uji pelengkap dilakukan dengan menginokulasikan koloni
bakteri pada medium agar dengan cara digoreskan dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 35C. agar yang digunakan adalah endo agar
dan Eosin Metil Blue (EMB). Pembenihan pada media agar ini
mengakibatkan media agar menjadi bewarna ungu tua dengan kemilau
tembaga metalik dan membentuk koloni dengan pusat gelap (Willey,
2008).
Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau
unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Namun, pada
umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai jumlah individu bakteri.
Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram.
Misalnya terdapat nilai MPN 10/gram dalam sebuah sampel air,
artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10

3|MIKROBIOLOGI
 coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut
makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum. Metode MPN
mempunyai limit kepercayaan 95% sehigga pada setiap nilai MPN
terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi.

C. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Botol sampel
b. Rak tabung reaksi
c. Tabung reaksi
d. Tabung durham
e. Mikro pipet
f. Bunsen
g. Korek api
h. Inkubator
i. Pipet volume 1 Ml, 5 mL, dan 10 mL
j. Luminar air flow
k. Aluminium foil
l. Penyemprot alkohol

2. Bahan
a. LBSS (Laktosa Broth Single Strecht)
b. LBDS (Laktosa Broth Double Strecht)
c. BGLB (Bile Green Laktosa Broth)
d. Tisu
e. Alkohol
f. Sampel es jeruk
D. Prosedur Kerja
a. Tes perkiraan (Presumtive test)
Media yang digunakan adalah LBSS (Laktosa Broth Single Strecht) dan
LBDS (Laktosa Broth Double Strecht)dan LBDS

4|MIKROBIOLOGI
 Cara pemeriksaan :
Siapkan 7 tabung reaksi yang masing-masing berisi media LBSS (2
tabung), media LBDS (5 tabung), sebanyak 5 ml tabung disusun
pada rak tabung reaksi, masing-masing tabung di beri nomor urut

Dengan pipet steril ambil bahan pemeriksaan yang telah disiapkan

Masukkan ke dalam tabung 1 sampai dengan 5 masing-masing
sebanyak 10 mL, tabung ke 6 sebanyak 1 mL, tabung ke 7 sebanyak
0,1 mL Masing-masing tabung digoyang-goyang agar sampel
tercampur rata

Inkubasi pada suhu 35-37C dan pada suhu selama 24 jam

Setelah 24 jam, liaht ada tidaknya pembentukkan gas pada tabung
durham. Catat semuatabung yang menunjukkan peragian laktosa
(pembentukan gas)

Jika pembentukan gas pada tabung durham dinyatakan positif, maka
dilakukan dengan tes penegasan

Apabila tes pada 24 jam pertama tdak menunjukkan gas, maka
dimasukkan kembali selama 24 jam, jika postif maka dilanjutkan
dengan tes penegasan

Bila tes negatif maka berarti coliform negatif

b. Tes penegasan (Confirmative test)

Media yang digunakan adalah media BGLB (Bile Green Laktosa
Broth). Tes ini dilakukan untuk menegaskan hasil positif dari tes
penegasan

5|MIKROBIOLOGI
 Cara pemeriksaan:
Dari tiap tabung presumtive yang positif, dipindahkan 1-2 ose
kedalam tabung konfirmative yang berisi 10 mL BGLB

Dari tiap tabung diinokulasikedalam 2 tabung BGLB

Satu seri tabung BGLB diinkubasi pada suhu 37C selama 24-48 jam
(untuk memastikan adanya coliform) dan satu seri tabung BGLB
diinkubasi pada suhu 44C selama 24-48 jam (untuk memastikan
adanya coli tinja)

Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah
tabung BGLB yang menunjukkan positif gas

Diamati terbentuknya gas pada setiap tabung jumlah tabung BGLB
yang positif gas dicatat dan hasilnya dirujuk ke tabel MPN 1

E. Hasil Pengamatan

Alamat Media Suhu

Kel Sampel pengambilan Warna 370 44
LBSS LBDS 0
sampel C C
Air
Koperasi UMP
manisan
jalan RTA. Milono
1. buah kuning - 5 3 3
km 1,5
kedondon
palangkaraya
g
2. Es jeruk Jalan galaxy oren 2 5 7 -
Jln. Seth adji ujung
3. Es kelapa putih 2 5 7 2
dekat haur kuning

6|MIKROBIOLOGI
 Air isi
4. Jln. Hiu putih raya bening 2 5 7 -
ulang
Jln g.obos induk
5. Es kelapa putih 2 5 7 2
(samping my salon)
Coklat
6. Es teh Jln. G.obos 10 kemera 2 3 5 3
han
7.
Jln s. Parman
Es sirup (bawah jembatan merah 2 5 7 -
kahayan)

Es sirup
8. leci Jln. M.H thamrin
(samping SDN-4 putih 2 5 7 3
menteng)

2 5
Es jeruk Jln. Seth adji
9. perempatan oren 1 -
Hari Hari
christopel mihing
ke-2 ke-2

F. Pembahasan
Pemeriksaan air secara mikrobiologi sangat penting dilakukan
karena air merupakan substansi yang sangat penting dalam menunjang
kehidupan mikroorganisme yang meliputi pemeriksaan secara
mikrobiologi baik secara kualitatif maupun kuantitatif dapat dipakai
sebagai pengukuran derajat pencemaran.
Pada praktikum kali ini dilakukan pemeriksaan sampel minuman
yang bertujuan untuk mengetahui kualitas dari air minum tersebut.
Penentuan kualitas air minum secara mikrobiologi dapat dilakukan

7|MIKROBIOLOGI
berdasarkan analisis kehadiran golongan bakteri E-coli. Dalam
pemeriksaan kualitas sampel minuman yang digunakan, minuman yang
digunakan merupakan minuman yang sering dikonsumsi dimasyarakat
misalnya saja air isi ulang, es jeruk, es kelapa, dsb.
Dalam praktikum yang dilakukan, sebelum melakukan pengujian
sampel, dilakukan penyeterilan alat praktikum dan penyeterilan media
agar tidak ada mikroba lain yang tumbuh pada alat yang digunakan untuk
membuata media dan tempat sampel. Penyeterilan alat dilakukan dengan
cara mengoven alat yang akan digunakan selama 20 menit. Sedangkan
sterilisasi media dilakukan dengan autoklaf selama 20 menit untuk
menghindari tumbuhnya mikroba lain yang tumbuh.
Dalam metode MPN ini digunakan pemeriksaan dengan dua tahap
test yaitu test praduga dan test penegasan. Test praduga dalam praktikum
ini dilakukan dengan menggunakan 7 tabung reaksi yang berisi sampel dan
media LBDS dan LBSS sebanyak untuk tabung 1-5 sebanyak 10 mL,
tabung 6 sebanyak 1 mL dan tabung 7 sebanyak 0,1 mL untuk masing-
masing sampel yang diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37C,
sedangkan untuk test penegasan yaitu menggunakan hasil yang positif dari
test perkiraan dengan menggunakan dua pasang seri untuk suhu 37C dan
44C yang diinkubasi selama 2x24 jam.
Dalam praktikum kali ini menggunakan kontrol media negatif
dengan perlakuan tanpa menggunakan sampel. Tujuan dari digunakannya
kontrol media negatif yaitu untuk memastikan hasil penelitian yang positif
tercemar bakteri Coliform dan E-coli tinja itu benar-benar berasal dari
sampel bukan dari media atau cara pengerjaan dari praktikan.
Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan
untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti
Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan
penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman,
sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan
mengubah amonium menjadi nitrat.

8|MIKROBIOLOGI
 Dalam praktikum kali ini menggunakan Media Lactose broth (LB)
digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran coliform dalam air,
makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment
broth) untuk Salmonella dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh
bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien
esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber
karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform.
Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk
coliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5%
pepton; dan 0,5% laktosa. Media BGBB (Brilliant Green Bile Broth)
digunakan untuk mengkonfirmasi hasil tes positif dugaan. Brilliant Green
Bile Broth (BGBB) juga disebut sebagai Brilliant Green Lactose Bile
Broth (BGLBB). Enzimatik Intisari dari Gelatin adalah sumber karbon dan
nitrogen digunakan untuk kebutuhan pertumbuhan umum di Brilliant
Green lactose Bile Broth. Oxbile dan Brilliant Green menghambat bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif banyak, selain E.coli. Laktosa
merupakan sumber karbohidrat. Bakteri yang fermentasi laktosa dan
menghasilkan gas yang terdeteksi Penggunaan utama dari media ini
adalah untuk mengidentifikasi keberadaan E.coli pada makanan. Selama
inkubasi 24 jam pada suhu 37C E.coli akan memfermentasi laktosa dalam
kaldu dengan produksi gas dan Gas ini akan terkumpul dalam sebuah
tabung durham terbalik.
Dari hasil praktikum yang dilakukan kelompok kami dengan
menggunakan sampel es jeruk, sampel yang digunakan pada test penduga
menggunakan media LBSS dan LBDS, tidak terdapat hasil positif pada
saat setelah inkubasi selama 124 jam, setelah itu sampel kembali
dimasukkan kedalam inkubasi untuk dilakukan pengamatan pada 124
jam berikutnya, pada hari berikutnya sampel diamati dan langsung
dilakukan tes penegasan pada media BGLB dan diinkubasi selama 124
jam pada suhu 37C dan 44C untuk melihat apakah sampel positif
mengandung Coliform dan Coli tinja atau sampel tersebut negatif.

9|MIKROBIOLOGI
 Sampel yang positif bisa dilihat dari adanya kekeruhan dan
gelembung gas pada tabung durham. Setelah dilakukan test perkiraan lalu
sampel yang positif dilanjutkan dengan test penegasan menggunakan
media BGLB dengan dua suhu yang berbeda yaitu 37C dan 44C. Dari
kedua suhu tersebut hanya didapatkan hasil yang positif pada suhu 37C
tabung ke 7 dengan sampel 0,1 mL dengan nilai MPN nya yaitu pada suhu
37C adalah 2. Dengan nilai MPN yang kecil sampel bisa dinyatakan
sampel positif mengandung Coliform namun dengan kadar yang sedikit.
Standar baku mutu Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor
492 Tahun 2010 Tentang Persyaratan Kualitas Air Minum, bahwa air
untuk minum seharusnya tidak mengandung bakteri patogen dan kadar
maksimum E. coli pada air minum adalah 0/100 mL sampel. Dari hasil
praktikum yang sudah kami lakukan dan menghitung nilai MPN, Maka
sampel es jeruk yang digunakan pada saat praktikum membuktikan bahwa
sampel yang positif tersebut tidak layak untuk dikonsumsi masyarakat,
walaupun dengan nilai MPN yang kecil.

G. Kesimpulan
1. Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat
tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang
pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi
pertumbuhan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu.
2. Fungsi dari Media Lactose broth (LB) digunakan sebagai media untuk
mendeteksi kehadiran coliform dalam air, makanan, dan produk susu,
sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonella dan
dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya.
Sedangkan media BGBB (Brilliant Green Bile Broth) digunakan untuk
mengkonfirmasi hasil tes positif dugaan. Brilliant Green Bile Broth
(BGBB) juga disebut sebagai Brilliant Green Lactose Bile Broth
(BGLBB).

10 | M I K R O B I O L O G I
3. Metode yang digunakan dalam pemeriksaan kualitas air adalah metode
MPN (Most Probable Number) karena metode ini dapat mendeteksi
Coliform dalam jumlah yang sangat rendah.

11 | M I K R O B I O L O G I
 DAFTAR PUSTAKA
Association of Official Analytical Chemistry (AOAC). 2000. Official
Methods of Analysis. Mc Graw Hill Press. Canada
BPOM. 2004. Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan
No.HK.00.05.4.2411 Tentang Ketentuan Pokok Pengelompokkan
dan Penandaan Obat Bahan Indonesia. Jakarta
Dad.2000.Bacterial Chemistry and Physiology. John Wiley & Sons, Inc.,
New York
KepMenKes RI. 2010. Surat Keputusan Menteri Kesehatan Nomor
492/menkes/PER/IV/2010 Tentang Persyaratan Kualitas Air
Minum. Jakarta.
Suriawira U (2008). Mikrobiologi Air & Dasar-dasar Pengolahan Buangan
Secara Biologis. Bandung : Penerbit Alumni.
Willey, joanne M, Linda M. Sherwood, Christopher J (2008). Prescott,
Harley, and Kleins Microbiology. New York : Mc Graw Hill, pp
272-274.

12 | M I K R O B I O L O G I