PEMERIKSAAN MPN COLIFORM

METODE TABUNG GANDA PADA SAMPEL TANAH

A. PENDAHULUAN
Hasil pemeriksaan MPN Coliform metode tabung ganda dinyatakan dengan
jumlah perkiraan terdekat kuman golongan Coli yang terdapat dalam 100 gr contoh
Tanah (Most Problem Number = MPN).
Tujuan dari pemeriksaan MPN Coliform pada tanah, ialah mencari atau
menentukan adanya bakteri golongnan Coli atau E. Coli dalam contoh tanah yang
terkontaminasi oleh tinja.
Pemeriksaan MPN Coliform metode tabung ganda didasarkan bahwa bakteri
golongan Coli dapat meragikan laktosa, membentuk asam dan gas. Untuk ini
digunakan metode sebagai berikut :
1. Tes Perkiraan (Presumtive Test)
Perbenihan yang diperlukan adalah Lactosa Broth yang Single Strength (SS) dan
Double Strength (DS). Lactosa Broth Doubel Sterengt dipakai untuk pengenceran
yang lebih besar (10 ml) dan Lactosa Broth Single Strength dipakai untuk
pengenceran yang lebih kecil (1 ml dan 0,1 ml). Sedangkan jumlah tabung yang
dipakai ada bermacam-macam kombinasi, seperti :
No. Jumlah Tabung Volume Air
5 tabung LB DS 10 ml contoh tanah yang diencerkan
dengan air pengencer

5 tabung LB SS 1 ml contoh tanah yang diencerkan dengan

air pengencer

5 tabung LB SS 0,1 ml contoh tanah yang diencerkan

dengan air pengencer

Sesudah masing-masing tabung diiisi dengan contoh air dengan menggunakan pipet
ukur secara aseptis, kemudian disimpan ke dalam lemari pengeram (Incubator)
dengan suhu 35 – 37 oC selama 2 x 24 jam.
Tiap-tiap tabung yang menunjukkan peragian (keruh) dan adanya gas, maka tabung
itu diperkirakan mengandung kuman golongan Coli, atau positif.
Dari tabung ini perlu diteruskan pada Tes Penegasan (Confirmatory Test).

2. Tes Penegasan (Confirmatory Test)

Pembenihan yang dipakai adalah B.G.L.B (Brilliant green Lactose Bile Broth).
Adapun yang diperiksa adalah semua tabung yang positif (keruh + gas) pada
Lactose Broth. Pindahkan dengan jarum ose dari tiap-tiap tabung yang positif ke
B.G.L.B kemudian masukkan ke dalam inkubator 35 – 37 oC selama 1 x 24 jam.
Tabung yang menunjukkan keruh dan gas dianggap positif.
Hasil pemeriksaan pada tes penegasan ini dapat dibaca dalam tabel MPN Coliform,
sesuai dengan jumlah tabung yang dipergunakan. Misalnya di dalam tabel kita
mendapatkan angka MPN = 5, ini berarti bahwa di dalam 100 gr contoh tanah
terdapat 5 kuman golongan Coli.

Syarifudin A, S.KM, M.S.

 3. Tes Lengkap (Complete Test)
Pembenihan yang dipakai adalah :
 Endo agar plate atau Eosin Methylen Blue (EMB) agar plate
 Pepton untuk indol
 Methyl red
 Voges Proskauer
 Citrat media
Tes ini ditujukan untuk menentukan jenis dari Coliform misalnya E. Coli,
A.aerogenes, E. freundii, dan lain-lain dengan melihat hasil peragian kuman (test
Biokomia) pada media :
Media E. Coli A. aerogenes
1. Indol + -
2. Methyl red + -
3. Voges Proskauer - +
4. Citrat - +

B. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
 Pipet steril 1 ml dan 10 ml
 Lampu spritus
 Jarum ose
 Kapas
 Inkubator
 Spidol + label
 Rak tabung reaksi
2. Bahan
 Lactose Broth Single Strength (LBSS)
 Lactose Broth Double Strength (LBDS)
 Brilliant Green Lactose Bile (BGLB)
3. Sampel
 Air / Makanan

C. TEKNIK PEMERIKSAAN
 Persiapan Sampel

 Sampel Tanah :
1. Timbang 10 gr sampel tanah masukkan dalam botol yang telah berisi 90 ml
buffer posfat steril .
2. Kocok, dengan cara dibolak-balik beberapa kali sampai homogen.
3. Lakukan secara aseptis.

 Tehnik Pemeriksaan
1. MPN COLIFORM
a. Persumtif Test (Tes Perkiraan)
1. Siapkan tabung LB DS dan LB SS dan beri label sesuai dengan ragam
pemeriksaan yang digunakan sesuai dengan jenis sampel yang diperiksa.
2. Dengan pipet steril 10 ml pindahkan 10 ml sampel ke dalam tabung
LB DS. Dengan pipet 1 ml pindahkan 1 ml sampel kedalam tabung LB SS
dan 0,1 ml kedalam tabung LB SS lainnya .

Syarifudin A, S.KM, M.S.

 3. Tabung-tabung di dalam rak digoyang, supaya sampel bercampur rata
dengan media, kemudian diberi label.
4. Eramkan dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 2 x 24 jam.
5. Tiap tabung yang keruh dan timbul gas pada tabung durham, maka
menurut test perkiraan mengandung bakteri golongan Coli (positif) dan
bila tidak ada gas maka test perkiraaan dinyatakan negatif.
6. Pembacaan hasil.
Misalnya ; Tabung LBDS positif sebanyak 3 tabung, tabung LBSS 1 ml
positif dan tabung LBSS 0,1 ml negatif berarti hasilnya
adalah : 3/5 ; 1/1 ; 0/1

b. Confirmatory Test (Tes Penegasan)

1. Dari masing-masing tabung yang pada test perkiraan dinyatakan positif,
ditanam masing-masing 1 ose ke dalam media BGLB.
2. Eramkan ke dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 1 x 24 jam.
3. Pembacaan hasil.
Misalnya ; Tabung BGLB dari LBDS positif 2 tabung, tabung BGLB dari
LBSS 1 ml positif dan tabung 0,1 ml negatif, berarti hasilnya
adalah :
MPN Coli 2 1 0 dalam tabel 7,6.
Hal ini menunjukkan bahwa dalam 100 gr sampel tanah tersebut terdapat 7,6
bakteri golongan Coli.

c. Completted Test (Test lengkap)

Test lengkap dilakukan bertujuan untuk mencari adanya E.Coli dalam sampel
yang diperiksa.
a. Ambil 1ose cairan dari BGLB yang positif dan tanamkan pada Endo agar atau
EMB agar secara zig-zag atau garis lurus.
b. Eramkan dalam inkubator selama 1 x 24 jam.
c. Apabila tumbuh koloni berwarna merah metalik pada Endo agar atau koloni
berwarna hijau metalik dengan bagain tengah berwarna hitampada EMB agar,
kemudian koloni ini ditanam pada TSI agar, SIM Medium dan Citrat agar
untuk memastikan adanya E. Coli.
d. Eramkan dalam inkubator 1 x 24 jam.
e. E. Coli positif apabila hasil reaksi biokimia sebagai berikut :
TSIA = +/+ {GAS (+) ; H2S (-)}
SIM = (-)
Citrat = (-)

2. Golongan Coli Tinja

Untuk menentukan golongan Coli, apakah berasal dari tinja manusia
(feaces) atau dari sumber lainnya maka dipakai cara dengan menaikkan temperatur
pengeraman menjadi 44 – 46 oC.
Media biakan yantg dipakai untuk golongan Coli tinja adalah BGLB 2 %
yang dieramkan pada temperatur 44 – 46 oC. Penentuan selanjutnya sama seperti
yang dilakukan untuk test lengkap.

Syarifudin A, S.KM, M.S.

D. PERHITUNGAN
1. Sampel Tanah
100
Nilai MPN/100 gr = X Nilai MPN pada tabel
10

E. PENILAIAN HASIL (INTERPRETASI HASIL)

Penilaian laboratorium terhadap MPN Coloform yang diperoleh dari hasil
pemeriksaan pendahuluan dan pemeriksaan penegasan dibandingkan dengan nilai
standart yang tertera pada peraturan yang ada.

Syarifudin A, S.KM, M.S.