Uji Kontaminan Mikroba

dalam Pangan
Bakteri Coliform (samb.2)
1
 Bakteri coliform

Bentuk batang pendek, Gram negatif, aerob dan fakultatif anaerob,

tidak membentuk spora dapat menfermentasi laktosa & menghasilkan
gas pada suhu 32 C selama 48 jam

Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae,

Citrobacter, Erwinia

Bakteri indikator- berasosiasi dengan jalur intestin, keberadaannya

dalam makanan – merupakan kontaminasi dari jalur intestin (feses)
Uji coliform – terjadinya (re)kontaminasi & evaluasi proses sanitasi,
baik pada proses pemerahan susu, setelah pasteurisasi, penyimpanan,
dan proses-proses berikutnya
Presumptive test – Positive
1. Koloni berwarna merah gelap, diameter 0,5 mm muncul setelah 24
+ 2 jam inkubasi suhu 32 C pada media VRBA (violet red bile agar)
2. Pada media 2% brilliant green lactose bile broth (BGLB) terbentuk
gas setelah fermentasi 48 + 3 jam pada suhu 32 C

Complete test – Positive

Pada Eosin Metilen Blue (EMB) agar, 32 C, 24 jam – koloni
berwarna hijau metalik
Pada laktosa cair, 32 C, 48 jam – memproduksi asam dan gas
Pada nutrien agar, 32 C, 24 jam - Gram negatif, batang pendek, dan
tidak membentuk spora
Coliform test – pada media padat

Media yang digunakan VRBA (Violet red bile agar)

1 ml sampel (atau diencerkan terlebih dahulu) dimasukkan ke dalam
cawan dan ditambah 10-15 ml media yang masih mencair (atau 4 ml
sampel ditambah 15-20 ml media), tergantung dari perkiraan populasi
coliform
Dilapisi lagi dengan media VRBA untuk mencegah pertumbuhan koloni
di permukaan
Inkubasi (posisi terbalik) selama 24 + 2 jam pada 32 C
Koloni coliform berwarna merah gelap diameter 0,5 mm
Pemeriksaan bakteriologis meliputi : penghitungan
TPC, penghitungan MPN dan Identifikasi E.coli dan
penentuan Strain E.coli O157:H7

Metode pemeriksaan bakteriologi dilakukan secara:

a.Kualitatif:
- presumptive test
- comfirmed test
- completed test
b. Kuantitatif:
-Total Plate Count (TPC)
- MPN (Most Probable Number):
yaitu perkiraan jumlah kuman yang mendekati
per ml /gram
A.Cara pengambilan sampel:

1.Persiapkan wadah steril

2.Siapkan formulir tentang lokasi pengambilan,
tanggal pengambilan dan kode sampel
3.Masukkan sampel ke dalam wadah steril
tersebut
4.Wadah diberi kode, lokasi sampling dan tanggal
pengambilan sampel dengan menggunakan spidol
tahan air
5.Masukkan ke dalam box es yang telah disiapkan
sebelumnya
6.Kirim sampel ke laboratorium untuk diperiksa
6
B. CARA KERJA DI LABORATORIUM :

(1).Persiapan sampel mikroba.

- Masing-masing sampel ditimbang 10 gram dimasukkan

ke dalam gelas ukur, kemudian ditambahkan larutan
buffer phosphat pH.7.0 hingga mencapai volume 100
ml, kemudian dikocok sampai homogen .
- Dengan menggunakan pipet steril, pindahkan 1 ml
suspensi di atas ke dalam larutan buffer Phosfat
Lakukan pengenceran sampai di dapat (pengenceran
10-1) , kemudian sebanyak 1 ml dari tiap pengenceran
tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam 9 ml buffer
phosphat (pengenceran 10-2), demikian seterusnya
sampai pengenceran yang diinginkan.
8
9
2). Penentuan Nilai TPC Bacteria dengan Pour
Plate Methods ( Metode Tuang)

Metode ini bertujuan menghitung nilai Total Plate Count

Bacteria /TPC ( Angka Lempeng Total/ALT) suatu bahan

Prinsif : pertumbuhan bakteri pada media setelah

diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam

Nilai TPC ditentukan dengan cara menanam tiap contoh :

a. 1 ml contoh bahan dan
b. 1 ml contoh bahan dengan penipisan 1 : 101 ,
10 2 dan 1 : 103 masing- masing pada lempeng nutrient
secara pour plate .

Hasil pertumbuhan koloni dihitung dengan quibec coloni

counter dan dinyatakan dalam jumlah kuman per ml bahan.
- Masing-masing pengenceran diambil 1 ml
diinokulasikan pada media Nutrient Agar
dengan sistem tuang, Kemudian
diinkubasikan pada suhu 370 C selama 24-
48 jam.

- Koloni yang tumbuh dihitung sebagai Total

Plate Count (TPC).

- Dari pengenceran 10-1, diambil 0,1 ml

diinokulasikan pada media Mac Conkey
agar untuk pengujian E.coli.
15
3).Konfirmasi untuk Coliform dan F.
coliform

Sampel dari setiap pengenceran (10-1, 10-2,10-3)

diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 3 tabung
yang berisi lactose broth dan Brilliant Green Bile
(BGB) 2%.

Broth diinkubasikan selama 24 jam pada suhu

370C. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya
gas pada tabung tersebut dan selanjutnya
dihitung
 4). PEMBIAKAN SAMPEL
(1).Nutrien Agar
(2).SS Agar
(3).Mac Conkey Agar
(1).Nutrien Agar
- Dari tiap pengenceran di atas diambil 1 ml dan
dimasukkan ke dalam petridish
- Tuangkan sebanyak 15-20 ml nutrien agar ke
dalam petridish tersebut di atas
- Goyangkan cawa petridish sedemikian rupa
sehingga sampel dan agar tercampur merata
- Setelah agar membeku, balikkan cawa petridish
dan inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam
- Hitung koloni yang tumbuh
17
(2). SS Agar
- Ambil satu sengkelit sampel dari
pengenceran di atas dan goreskan pada
permukaan media SS Agar secara zigzag
- Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24
jam
- Amati koloni yang tumbuh
- Bila ditemukan koloni tidak berwarna/
bening, maka koloni tersebut tersangka
sebagai Salmonella

18
(3). Mac Concey Agar
- Ambil satu sengkelit sampel dari
pengenceran di atas dan goreskan pada
permukaan media MC Agar secara zigzag
- Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24
jam
- Amati koloni yang tumbuh
- Bila ditemukan koloni berwarna merah
jambu, bulat dan besar, maka koloni
tersebut tersangka sebagai E.coli

19
B. Metode MPN (Most Probably
Number)
1.Penentuan MPN presumptive coliform
- Pada pemeriksaan ini dipakai laktosa broth
- Siapkan 7 tabung reaksi yang berisi LB
sebanyak 10 ml
- Pipet sampel 10 ml, lalu masukkan ke dalam
tabung 1-5
- Pipet sampel 1 ml, lalu masukkan ke tabung 6
- Pipet sampel 0,1 ml, lalu masukkan ke dalam
tabung 7
- masing-masing tabung dihomogenkan
- Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam
- Hasil (+) dinyatakan dengan terbentuknya gas pada
tabung durham dan dilanjutkan dengan tes penegasan
- Hasil (-) berarti coliform negatif dan tidak perlu
dilakukan tes penegasan
Prosedur pengujian total coliform dengan metode MPN (FDA, 1995)
2. Test Penegasan

-Dari tiap tabung yang positif pada test awal, dipindahkan

1-2 ose ke dalam tabung yang berisi 10 ml BGLB 2 %. Dari
masing-masing tabung penegasan diinokulasikan ke dalam
dua seri
Satu seri tabung BGLB 2 % diinkubasikan pada suhu 37o
C selama 24 jam untuk coliform. Satu seri tabung BGLB
lainnya diinkubasikan pada suhu 44 o C selama 24 jam
untuk colifecal

- Pembacaan dilakukan setelah 24- 48 jam dengan melihat

jumlah tabung BGLB yang menunjukkan (+) gas.
- Kemudian dicocokkan dengan tabel MPN Hoskin
J.K dan hasilnya dinyatakan dalam faecal coliform /gr
sampel.
Tabung positif : 5 4 1
24
Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu
hitung tabung positif untuk tiap seri.
25
Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka
tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga
diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.

Misalkan . Diperoleh kombinasi jumlah tabung positif :

321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.