Tata Cara Perlakuan Hewan Coba

Injeksi Protein Antigen dan Protein Adjuvant

Protein adjuvant divortex terlebih dahulu sebelum digunakan selama 5
menit. Pada hari ke-1, mencit diinjeksi protein permukaan dan complete Freuds
adjuvant (CFA), yang sebelumnya dicampur terlebih dahulu dan divortex selama 5
menit,

dengan perbandingan 1:1 masing-masing sebanyak 50 l secara

intraperitonial. Pada hari ke-8, 15, dan 22, mencit mendapatkan booster berupa
protein incomplete Freunds adjuvant sebanyak 50 l. Berikut merupakan alat dan
bahan yang digunakan.
Alat : spuit 1cc, tabung ependorf, mikropipet, blue tip, vortex
Bahan : suspensi antigen 50 L, CFA 50 L, IFA 50 L
Terminasi Hewan Coba
Hewan coba mencit diterminasi dengan cara cervical dislocation yang
sebelumnya dianestesi menggunakan eter untuk menghilangkan rasa sakit.
Terminasi hewan coba dilakukan di tempat yang berbeda dengan hewan coba
yang masih hidup.
Isolasi dan Pemurnian Serum dari Darah Mencit
Isolasi serum mencit pada penelitian ini dilakukan dengan cara mengambil
darah mencit dari jantung sebanyak mungkin yang bisa didapatkan dengan
menggunakan spuit 1cc. Sampel darah mencit dimasukkan ke tabung tanpa
EDTA. Selanjutnya, sampel darah didiamkan selama 20-30 menit dan
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit agar supernatan
terpisah dari pelet. Bagian yang digunakan adalah supernatan.
Alat : spuit 1cc, sentrifuge, tabung tanpa EDTA
Isolasi Eritrosit Mencit Balb/c
Mencit dibius dengan eter kemudian diambil darahnya melalui jantung.
Kemudian darah yang sudah diambil dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi

yang berisi EDTA. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama
10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, sedangkan pellet yang dihasilkan
ditambah dengan PBS pH 7,4 sebanyak 2 ml kemudian disentrifugasi lagi.
Langkah tersebut di atas dilakukan sebanyak 3 kali hingga diperoleh eritrosit
murni. Pellet diambil sebanyak 50 l dengan menggunakan pipet mikro dan
ditambahkan 10 ml PBS pH 7,4 secara bersamaan ke dalam cawan petri steril.
Cawan petri digoyangkan secara perlahan sampai homogen dan eritrosit murni
siap digunakan.
Alat : sentrifuge, tabung dengan EDTA, spuit 1cc, cawan petri
Bahan : PBS pH 7,4
Metode Isolasi Sel Enterosit Mencit Balb/c
Mencit Balb/c dianestesi dengan eter, kemudian diambil bagian usus
halusnya. Lumen usus halus dibuka dengan cara memotong melintang, kemudian
jaringan usus halus dipotong dengan ukuran 5 cm setiap potong. Usus dicuci
dengan PBS yang mengandung 1mM dithiothretinol pada suhu 40C dalam pH 7,4
sampai tampak bersih. Setelah itu, usus halus dimasukkan dalam cairan yang
mengandung 1,5 mM KCL, 9,6 mM NaCl, 27 mM Natrium Sitrat, 8 mM
KH2PO4dan 5,6 mM Na2HPO4dengan pH 7,3 (Larutan A). Selanjutnya, jaringan
diinkubasi pada shaking incubator selama 15 menit dengan suhu 370 C.
Supernatan dibuang dan jaringan dipindahkan dalam cairan PBS Ph 7,4 yang
mengandung 1,5 mM EDTA dan 0,5 mM dithiothretinol (Larutan B), digojok kuat
selama 15 menit pada suhu 370C. Selanjutnya, campuran disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 6000 rpm dan diulang 3 kali. Supernatan dibuang, dan
jaringan dicuci dengan PBS kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 4000 rpm dan diulang sebanyak 3 kali. Setelah waktu pencucian cukup,
maka jaringan usus disuspensikan dalam cairan PBS dengan pH 7,4.
Alat :scalpel, shaking incubator, sentrifuge
Bahan : usus halus mencit, Larutan A, Larutan B, PBS pH 7,4