I.

PENDAHULUAN

Hiperurisemia adalah penyakit metabolik akibat kelebihan produksi asam urat atau
gangguan ekskresi asam urat dalam tubuh. Hiperurisemia merupakan keadaan yang
ditandai dengan peningkatan kadar asam urat dalam darah yang melebihi batas normal
yaitu di atas 7,0 mg/dl pada pria dan diatas 6,0 mg/dl pada wanita. Pada keadaan normal,
asam urat memiliki fungsi yang sangat baik bagi tubuh yaitu sebagai antioksidan.
Sedangkan, pada keadaan hiperurisemia plasma dan cairan ekstraseluler sangat jenuh
terhadap asam urat, sehingga mempermudah pembentukan kristal dan mengakibatkan
manifestasi klinis yang disebut gout. Asam urat berlebihan dalam serum dapat
menyebabkan nefrolitiasis dan gout, bahkan akibatnya pada hiperlipidemia, hipertensi,
diabetes tipe II, dan kardiovaskular penyakit . Selanjutnya, hiperurisemia kronis terkait
dengan nefritis interstitial dan gagal ginjal progresif. Serum asam urat berasal dari eksogen
(makanan mengandung purin) dan metabolisme purin endogen. Untuk mencegah dan
mengobati hiperurisemia dan gout yaitu mengurangi asupan makanan tinggi purin
sehingga dapat mengurangi produksi asam urat dan menghambat sintesis asam urat atau
meningkatkan eksresi asam urat, efektif untuk mengendalikan kadar asam urat dalam darah
secara in vivo.

II. METODE PENGUJIAN

Hiperurisemia diinduksi oleh mekanisme peningkatan produksi asam urat atau penurunan
ekskresi asam urat dari ginjal. Saat ini, ada tiga metode utama untuk membuat model
hiperurisemia: pertama, menimbulkan hiperurisemia ketika memberi oral/injeksi hewan
dengan hipoksantin 600-1000 mg/kg, xanthine 600 mg/kg, adenine 150-300 mg/kg, ragi
15-30 g/kg , asam urat 250 mg/kg atau 350-700 mg/kg karena peningkatan asam urat
serum. Efek seperti itu juga akan diamati pada pemberian dengan inhibitor ekskresi asam
urat seperti etambutol 250 mg/kg, asam nikotinat 100 mg/kg. Kedua, sebagai penghambat
uricase, ketika memberi makan tikus 0,4 g/d dan asam urat 0,6 g/d selama 3-4 minggu,
asam oksonat dapat menyebabkan asam urat serum yang terus meningkat. Demikian pula,
ketika kalium oksonat 300 mg/kg ip sekali, asam urat serum pada tikus juga akan
meningkat. Ketiga, untuk menghancurkan gen oksidase urat (EC 1.7.3.3) pada tikus
dengan rekombinasi homolog dalam sel induk embrionik, dan kemudian tikus mutan yang
kekurangan oksidase sebagai model hiperurisemia, dihasilkan oleh rekombinasi gen.

1. Induksi dengan bahan kimia (Menggunakan Potassium oxonate dan adenin)

Eksperimen dilakukan pada tikus Sprague-Dawley (SD) berat 280–300 g dan mencit
Kunming berat 25–30 g keduanya diadaptasi selama 1 minggu sebelum percobaan. Semua
binatang diizinkan untuk makan diet standar dan minum ad libitum, dan disesuaikan
dengan kondisi percobaan pada 22 ± 2 ° C, kelembaban 60 ± 5% dan 12 jam periode
cahaya buatan.
Setelah 1 minggu adaptasi, tikus SD jantan diacak menjadi enam grup (n = 8). Kecuali
kelompok normal, tikus dari kelompok lain diinduksi oleh PO suatu penghambat asam
urat, untuk mendapatkan hiperurisemia akut

tikus secara intragastrik diberikan PO (300 mg / kg berat badan) 1 jam setelah

pemberian sampel dan kontrol positif (Probenecid). PO dan sampel yang diuji
disuspensikan dalam larutan akasia 5%, dan volume pemberian oral adalah 10 ml / kg
berat badan, sedangkan kelompok kontrol menerima larutan air akasia 5% dengan
volume yang sama.

Setelah pemberian PO, sampel darah (sekitar 0,6 ml) dikumpulkan dari pleksus vena
infraorbital di bawah anestesi eter pada 1 jam, 2 jam dan 4 jam dan kemudian
disentrifugasi pada 3500 g selama 10 menit

Serum supernatan dikumpulkan dan disimpan pada suhu -20 ° C sampai diuji. Asam
perklorat (0,3 M) 180 μl ditambahkan ke sampel serum 20 μl, vortex selama 10 detik
dan ditempatkan dalam bak air es selama 30 menit, kemudian, disentrifugasi selama 10
menit pada 10.000 g di bawah 4 ° C.

Supernatan dinetralkan dengan larutan 0,8 M Na2HPO4, dan menambahkan asetonitril

volume yang sama. Setelah disentrifugasi 10 menit pada 10.000 g di bawah 4 ° C,
supernatan di UltraAnalisis Kromatografi Cair Kinerja (UPLC)untuk megukur tingkat
asam urat
Induksi Adenin dan PO (potassium oxonat)

mencit Kunming jantan diberikan secara intragastrik adenin (75 mg/k /hari, volume 20
ml/kg) dan PO (200 mg/kg /hari, volume 20 ml/kg), dan satu jam kemudian, sampel
dalam akasia 5% diberikan secara oral dengan volume 5 ml/kg. Selama 2 minggu

Perawatan yang sama dilakukan setiap hari selama 2 minggu berturut-turut. Sampel
darah dikumpulkan dan dianalisis kadar asam urat serum. Pengumpulan sampel urin,
clearance asam urat (Cur) dan kreatinin (Ccr), ekskresi fraksional asam urat (FEUA)
dihitung sebagai metode literatur (Perez-Ruiz et al., 2002), sebagai berikut:

Cur=Uv x Uur/Sur;

Ccr=Uv x Ucr/Scr;

FEUA=(Uur Scr)/(Sur Ucr)x100

-Histopatologi jaringan ginjal

Jaringan ginjal tikus diambil, difiksasi dengan paraformaldehyde 4% dalam Phosphate-

Buffered Saline (PBS),

didekalsifikasi selama 10 hari dengan EDTA dan diembeding dalam parafin untuk
analisis histologis. Bagian parafin diwarnai dengan hematoxylin (HE) dan eosin
-Analisis RT-PCR dan western blot (untuk mengetahui ekspresi protein dan mRNA)
Dilakukan isolasi RNA, sintesis cDNA dan analisis PCR real-time. Primer yang
digunakan untuk PCR real-time OAT1: 5′ GTTGCTCCCCTACTGCTGATGGCTT-3
′; 5′-AGATTCGGGTCGTCCTTGCTTGTCC-3 ′. GLUT9: 5′-CTCCTACTGCTT
CCTCGTCT-3 ′; 5′-GGTTCTGTTCTTGGTCTCCG-3. Selain URAT1, GLUT9 dan
transporter anion organik (OAT) memainkan peran penting dalam reabsorpsi urat
ginjal

Western blot :

Konsentrasi protein supernatan diukur dan diukur menggunakan asam bicinchoninic.

Jumlah protein yang sama (40-80 μg) dicampur dengan 8-12% SDS-polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS-PAGE) dan dipindahkan untuk membran polyvinylidene
diflyoride (PVDF).

Bintik protein normal diblok. Membran diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C dengan
antibodi primer. Bercak dicuci 3 kali dengan Tris Buffered Saline dengan Tween 20
dan diinkubasi dengan peroksidase terkonjugasi antibodi sekunder selama 1 jam

Bercak dicuci 3 kali dengan TBST. Protein yang ditransfer divisualisasikan dengan
chemiluminescence

-Efek penghambatan transport asam urat pada ekspresi sel hURAT1

hURAT1 garis sel epitel ginjal epitel manusia (HEK293-hURAT1) dan sel tiruan yang
sesuai (HEK293-pcDNA3.1). Sel ditempatkan di 24 well lates dengan kepadatan 1 ×
105 per sumur menggunakan DMEM mengandung 10% serum janin sapi
 Setelah 48 jam inkubasi di tempat yang atmosfer lembab yang mengandung 5% CO2
pada 37°C, media kultur sel diganti dengan 1 ml/well larutan HBSS. Setelah 10 menit
inkubasi, sel-sel dipindahkan ke buffer HBSS yang mengandung 5 μM urate masing-
masing selama 5 menit.

Reaksi dihentikan dengan menghilangkan buffer inkubasi dan mencuci monolayer tiga
kali dengan 500 μL larutan HBSS dingin. Selanjutnya, sel-sel dilarutkan dengan
inkubasi dalam 0,4 ml 1 NNaOH selama 30 menit dan dinetralkan oleh 1 N HCl. 14C
dari sel diukur dengan liquid scintillation counting

-Efek peningkatan transpor asam urat melintas Sel HCT116

Sel HCT116 dikultur di DMEM ditambah dengan 10% serum janin sapi pada 37°C di
bawah atmosfer 5% CO2 di udara. HCT116 Sel-sel ditempatkan ke penyangga
permeabel yang terbuat dari polietilen tereftalat dalam 12 well plates dengan kepadatan
1,8 × 105 sel/sumur.

Transport asam urat dikur dengan menambahkan media transport (5,36 mM KCl,
136,89 mM NaCl, 0,34 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 4,17 mM NaHCO3, 1,26
mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2, 0,41 mM MgSO4, 19,45 mM glukosa, 10 mM
HEPES/Tris, pH 7,4) mengandung asam urat 0,5 mM di sisi donor dan media transport
tanpa asam urat ke sisi receiver

Setelah 30 menit inkubasi, buffer transport dari sisi receiver diambil untuk
menghitung jumlah transport transelular asam urat. Analisis asam urat sampel debngan
metode UPLC.

-Analisis statistik

Data dievaluasi dengan analisis varian satu arah (ANOVA) dan Tukey's Studentized range
test digunakan untuk evaluasi post hoc. P <0,05 dianggap signifikansi.
 2. Induksi dengan bahan kimia (PO dan ekstrak ragi

Mencit dibagi secara acak menjadi enam kelompok (1) mencit dalam keadaan normal
kelompok kontrol diberikan secara intragastrik dengan 0,5 mL saline 7 hari berturut-
turut; (2) mencit dalam kelompok model secara intragastrik dengan 0,5 mL saline
selama 6 hari dan diberi PO (250 mg/kg) dan ekstrak ragi (7,5 g/kg) pada hari ketujuh
(3) mencit dalam grup AP (allopurinol) secara intraperitoneal disuntikkan dengan 5 mg
/ kg AP setiap hari, tetapi pada hari ketujuh, mereka diberi AP 1 jam setelah
pemodelan; kelompok (4) - (6) kelompok diberi perlakuan intragastrik dengan 10, 20
dan 50 mg/kg sampel uji, masing-masing, selama 6 hari, dan pada hari ketujuh, mereka
diberi sampel uji 1 jam setelah pemodelan. 12-jam sebelum pemberian obat mencit
dipuasakan.
III. PENUTUP
IV. DAFTAR PUSTAKA
Research progress for animal hyperuricemia model

Article in Chinese Pharmacological Bulletin 20(4):369-373 · April 2004 GL Chen

Zhanga Y., dkk. Effect and mechanism of dioscin from Dioscorea spongiosa on uric acid
excretion in animal model of hyperuricemia. Journal of Ethnopharmacology.2017

Zhua C., dkk. The anti-hyperuricemic effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on

hyperuricemic mice. Biomedicine & Pharmacotherapy.2017