Nama : Resi Amelia Vega

NPM : 412119022
PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULAR 1 ISOLASI DNA HEWAN
Video 1 (DNA Extraction by Phenol/ Chloroform)
Alat
1. Mikrotube
2. Centrifuge
3. Mikropipet
4. Rak mikrotube
5. tip (biru,putih,kuning)
6. inkubator
Bahan
1. Buffer lisis
2. Fenol/kloroform/isoamil alkohol
3. Proteinase K
4. RNAse
5. TE Buffer
6. EtOH
Cara Kerja :
1. Tambahan 700 ul buffer lisis ke dalam pelet sel resuspend sel
2. Tambahkan 10 ul RNAseA (10mg/ml)
3. Inkubasi pada suhu 37 derajat celcius selama 1 jam
4. Tambahkan 10ul proteinase K (20mg/ml)
5. Inkubasi pada suhu 50 derajat celcius semalam
6. Tambahkan 700ul fenol/kloroform/isoamil alcohol (25:24:1) lalu campur dengan baik
7. Sentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit
8. Pipet fase air ke tabung baru
9. Ulang (tambahkan fenol/kloroform/isoamil alcohol) kedalam fase berair lalu sentrifugasi
kemudian kumpulkan fase berair. Langkah untuk 2 kali
10. Tambahkan 700ul kloroform
11. Sentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit
12. Fase air dipipet ke tabung baru
13. Ulangi (tambahkna kloroform ke fase berair lalu sentrifugasi lalu kumpulkan fase berair)
langkah 1 kali
14. Tambahkan sepersepuluh volume NaOAc 3M
15. Tambahkan dua volume 100% EtOH
16. Setelah pencampuran, DNA mulai mengendap
17. Endapkan DNA hingga 1 hari pada suhu -70 derajat celcius
18. Sentrifugasi pada 13000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 derajat celcius
19. Buang supernatant
20. Cuci dengan 70% EtOH
21. Sentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit
22. Buang supernatant
23. Buang EtOH yang tersisa dengan pemipetan
24. Melarutkan pelet DNA delam volume TE buffer yang sesuai
Fungsi Reagen :
1. Buffer lisis berfungsi untuk menjaga struktur DNA selama proses lisis dan pemurnian.
2. RNAse berfungsi untuk mendegradasi RNA.
3. Proteinase K berfungsi untuk menghancurkan protein K.
4. Kloroform-Isoamil alkohol berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen
protein,polisakarida dan juga lemak.
5. Etanol berfungsi untuk menyebabkan DNA mengalami dehidrasi.
6. TE buffer berfungsi untuk menjaga kondisi larutan yang optimum bagi DNA selama
penyimpanan.

Video 2 (DNA Extraction from Sandfly - Phenol Chloroform method - Part 1)

Alat :

1. Sentifuse mikrotube
2. Disruptor cell
3. Thermomixer
4. Pipet
5. Tip
6. Mikrotube
7. Batang kaca
8. Aplikator kayu
9. Kaca pembesar
Bahan :

1. Buffer TENCa lisis

2. Sandlifies/ sandfly (lalat pasir)
3. Etanol 70%
4. Nitrogen cair
5. Buffer lisis
6. Proteinase K
7. Triton-X 100 deterjen non ionic non-denaturasi yang permeabilisasi membrane sel yang
mengganggu dan melarutkan protein membran
8. Manik manik cell disruption media

Cara Kerja :
1. Tambahkan 250ul buffer TENCa lisis ke setiap tabung
2. Gunakan batang kaca atau aplikator kayu untuk mengambil sandlifies dari mikrotube
yang berisi etanol 70%. gunakan kaca pembesar jika perlu
3. Sandfly keluar dari tabung etanol 70% dan ditransfer ke tabung buffer TENCa lisis
4. Dengan batang kaca, giling Sandfly menjadi potongan potongan untuk memastikan
ekstraksi DNA yang efektif
5. Aplikator kayu juga digunakan untuk menghancurkan sandfly secara mekanis
6. Nitrogen cair adalah metode lain untuk menghancurkan Sandfly menjadi beberapa
bagian
7. Tambahkan 20ul proteinase K
8. Tambahkan 2.5ul triton-X 100 ke konsentrasi akhir 1%
9. Pipet triton-X 100 perlahan ke buffer lisis dalam satu tekan
10. Tuangkan manik-manik (cell disruption media) kaca ke dalam mikrotube. Setengah isi
dari cairan
11. Kocok mikrotube dengan bead beater selama 5 menit pada 2800 rpm
12. Putar sesaat (15-20 detik) untuk memastikan sisa dalam buffer lisis, tidak tergantung
pada dinding tabung pada penutup
13. Setelah pemutaran, letakkan di blok termal selama 8 jam. Secara optimal pada suhu 50
derajat celcius protein terungkap sehingga memudahkan proteinase K untuk
menurunkannya
14. Bead beat mikrotube selama 1 menit setiap 30 menit selama 2-3 jam
15. Putar selama 15-20 menit untuk menenggelamkan Sandfly ke dalam buffer lisis
Fungsi Reagen :
1. Triton-X 100 berfungsi sebagai deterjen non ionik non-denaturasi yang permeabilisasi
membrane sel yang mengganggu dan melarutkan protein membran
2. Etanol 70% berfungsi untuk menyebabkan DNA mengalami dehidrasi
3. buffer TENCa lisis : menjaga struktur DNA selama prorses pelisisan/pemecahan sel
4. Nitrogen cair berfungsi untuk menghancurkan Sandfly menjadi beberapa bagian
5. Buffer lisis berfungsi untuk menjaga struktur DNA selama proses lisis dan pemurnian
6. proteinase K berfungsi untuk melisiskan sel serta mereduksi protein sehingga
memungkinkan DNA untuk berikatan dengan matriks pada kolom
7. manik manik cell disruption media berfungsi untuk menghancurkan sandfly