BIOLOGI MOLEKULER
INSTITUT KESEHATAN
MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa
atas berkat dan karunianya sehingga buku penuntun praktikum ini
dapat diselesaikan dengan tepat waktu. Buku Penuntun Praktikum
Biologi Molekuler ini disusun untuk membantu dan mewadahi
mahasiswa/i dalam melaksanakan proses pembelajaran dalam
melaksanakan praktikum biokimia di Institut Kesehatan Medistra
Lubuk Pakam.
Lubuk Pakam,
Oktober 2021
Penulis
i
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
DAFTAR ISI
Judul
Halama
n
KATA PENGANTAR i
DAFTAR ISI ii
ELEKTROFORESIS 5
ISOLASI PROTEIN 8
ELISA 9
DAFTAR PUSTAKA 12
ii
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
Tujuan
Untuk mengetahui dan memahami teknik isolasi genom dari DNA
Bahan
1. Larutan fenol jenuh dalam buffer Tris-HCl pH 8.0
2. Buffer TEN (Tris-EDTA-NaCl)
3. Enzim lysozim
4. Buffer TE (Tris-EDTA) pH 7.5
5. Larutan SDS (sodium dedosil sulfat) 10%
6. Isoamyl alkohol
7. Kloroform
8. Ethanol 99% dingin
9. Ethanol 70%
10. Enzim RNAse
11. Air steril
12. Es batu
13. Kultur murni mikroorganisme
14. Media yang sesuai
Alat
1. Sentrifuse (sebaiknya yang ada pendinginnya, dengan kecepatan bisa
diatur 12,000sampai 15,000).
2. Effendorf (tabung kecil)
3. Pipetman 10, 200, 1000 mikro liter
4. Inkubator (waterbath)
5. Tabung falcon, tabung sentrifuse tahan fenol.
Cara kerja:
a. Tumbuhkan kultur dalam 100 ml medium cair yang sesuai
b. Panen sel dengan melakukan sentrifugasi pada 3,500 rpm selama 20-30
menit
c. Bilas masa sel dengan 100 ml larutan buffer TEN yang telah
1
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
didinginkan di dalampecahan es
d. Suspensikan masa sel di dalam 12 ml larutan lyzozim dengan
kosentrasi 10 mg/l dalam buffer TE dan inkubasikan dalam water bath
suhu 37oC selama 1 jam
e. Tambahkan 6 ml larutan 100 g/l SDS 10% dan inkubasi kembali
pada suhu 37oCselama 1 jam
f. Tambahkan 9 ml larutan fenol jenuh (dalam buffer Tris-HCl, pH 8.0).
g. Tambahkan 9 ml larutan kloroform-isoamyl alkohol (24:1)
h. Suspensi disentrifuse dengan kecepatan 15,000 rpm pada suhu 5oC selama
30 menit
i. Bagian atas supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung falcon
(atausejenisnya, yang tahan terhadap fenol).
j. Tambahkan 2.5 kali volume alkohol 99% yang sudah didinginkan,
biarkan 15 menitdalam pecahan es
2
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
☻ Tips
DNA bisa diisolasi dengan menggunakan skala yang lebih
sedikit. Umumnya kultur dibiakkan dalam 5 ml media cair dan
DNA diisolasi dari 1 ml (bahkan 100 mikro liter) suspensi kultur
dengan cara di atas. Buatlah skala perbandingan sehingga
konsentrasi pelarut yang digunakan sesuai. Ekstraksi DNA
dengan skala kecil (small scale) ini, akan memudahkan apabila
kita mempunyai banyak sampel yang akan dikerjakan.
Disamping itu, DNA hanya dibutuhkan dalam jumlah yang
sangat sedikit untuk tujuan PCR (mungkin seitar 10-100 piko
gram) untuk satu kali reaksi PCR sudah lebih dari cukup.
Kecuali untuk keperluan kloning atau hibridisasi diperlukan
jumlah DNA yang lebih banyak (beberapa mikro gram).
3
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
Tujuan
Untuk mengetahui teknik amplifikasi DNA melalui teknik PCR.
Bahan
PCR set (1-6) yang terdiri dari:
1. dNTPs mix: yang merupakan campuran masing masing 10 mM dATP,
dCTP, dGTP,dTTP)
2. MgCl2
3. PCR buffer II
4. Forward primer
5. Reverse primer
6. TaqPolymerase
7. DNA template
8. Air steril
9. Es batu
10. Elektroforesis set (lihat protokol 8.2)
Alat
1. Tabung PCR 200 mikro liter (atau PCR tertentu menggunakan 500 mikro
liter)
2. Pepetman 0.5 – 10 mikro liter dan 10-200 mikroliter) dengan tip-nya
3. Mesin PCR
Cara kerja
1. Ke dalam tabung PCR (0.2 ml PCR tube) dimasukkan reagent sbb:
(sebaiknya DNA dimasukkan pada langkah terakhir sebelum
penambahan aquadessteril).
1. 5 dNTPs yang merupakan campuran masing-masing 10 mM
dATP, dCTP,dGTP, dTTP) (konsentrasi akhir 10 mM setiap dNTP).
2. 3.5 MgCl2 (75 mM)
3. PCR buffer II (10X PCR buffer)
4
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
5
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
95oC 95oC
2 mnt 3 mnt 72oC 72oC
2 mnt 7 mnt
50oC
30 dtk
5oC
35 kali siklus simpan
Gambar 1. Skematik reaksi PCR untuk identifikasi kapang dan kamir dengan
target 18S rDNA gen dan ITS.
6
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
ELEKTROFORESIS
Tujuan
Untuk mengetahui dan memahami proses elektroforesis pada sampel
DNA.
Bahan
1. DNA hasil isolasi
2. Agarose 1%
3. Loading bufer (bufer yang dipergunakan pada saat memasukkan sampel
ke dalam gel, biasanya berisi zat warna dan mengandung gliserol agar
DNA tidak menyebar di atas gel).
4. Bufer Tris-Asam asetat-EDTA (TAE: 1 kali strength)
5. Ethidium bromida (EtBr)
Alat
1. Elektroforesis set (chamber, sisir untuk membuat gel, cetakan gel, power
supply).
2. Pipetman 10 mikro liter dengan tip-nya
3. Sarung tangan
4. Transluminator (lampu UV)
5. Kamera
Cara kerja
a. Timbang agarose sebanyak 1 g dan tambahkan 100 ml buffer TAE 1X
b. Panaskan agarose sampai larut dengan sempurna.
c. Cor agarose pada cetakan yang standar digunakan. Sebelum agarose
memadat,letakkan comb untuk mecetak sumuran (well).
d. Angkat sisir (untuk membuat sumur sampel) kearah vertikal secara
perlahan-lahan.
e. Masukkan ke dalam chamber elektroforesis yang telah diisi dengan TAE
buffer 1X, dengan permukaan larutan buffer 2-3 mm di atas agar.
Perhatikan jangan sampai ada gelembung udara di bawah cetakan (tray)
agarose karena akan menghambat aliran listrik pada saat elektroforesis.
7
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
f. Pipet suspensi DNA (1-2 mikro liter), tergantung dari konsentrasi DNA.
Biasanya DNA yang diisolasi dari 1.5 ml kulture cair, dan DNA akhir
dilarutkan dalam 100 mikro liter buffer TE, diambil sebanyak 3-5 mikro
liter menghasilkan pita DNA yang bagus. Terlalu banyak DNA akan
memberikan pita yang terlalu tebal dan terkadang smear (fuzzy).
g. Teteskan di atas parafilm yang bersih dan tambahkan dengan loading
buffer (agar DNA tidak menyebar di atas permukaan agar). Biasanya
loading buffer dibuat 6X strength, sehingga 1 mikro liter loading buffer
ditambahkan dengan 5X volume DNA.
h. Masukkan sampel secara vertikal tepat di dalam sumur gel. Lakukan
hati-hati agarsampel tidak menyebar di atas agarose.
i. Gunakan ukuran (size) standar (marker untuk menentukan panjang
pita yang akan terbentuk). Umumnya untuk DNA genom digunakan
hinfIII digestion size standard,
8
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
Tujuan
1. Untuk mengetahui teknik pengukuran kadar DNA dengan
menggunakan metode plastic cling wrap.
2. Untuk mengetahui kadar DNA yang diukur dengan metode plastic cling
wrap
Cara kerja
9
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
10
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
ISOLASI PROTEIN
Tujuan
Cara kerja
Isolasi protein dari sampel organ hewan
1. Siapkan hewan coba yang akan digunakan dengan cara
melakukan dislokasi.
2. Bedah dan ambil organ yang akan digunakan.
3. Timbang 0.5g sampel dan cuci dalam PBS, lakukan sampai sampel benar-
benar terbebas dari darah yang menempel.
4. Hancurkan sampel dengan menggunakan mortal martil yang
sudah dibekukan (ingat lakukan proses ini pada suhu rendah).
5. Tambahkan 1 ml bufer ekstrak ke dalam mortal martil yang berisi
sampel yang digerus.
6. Ambil homogenat dan masukkan ke dalam tabung, lakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4ºC selama 20 menit.
7. Ambil supernatan yang didapat dan masukkan ke dalam tabung yang baru
dan selanjutnya gunakan untuk elektroforesis dan ukur juga kadar protein
yang terkandung di dalamnya dengan menggunakan spektrofotometer.
11
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
Tujuan
12
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
13
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
Data pengamatan
a. Intensitas warna (biru menjadi kuning)
Standart 5 (80pg/ml
Standart 4 (40pg/ml)
Standart 3 (20pg/ml)
Standart 2 (10pg/ml)
Standart 5 (80pg/ml
Standart 4 (40pg/ml)
Standart 3 (20pg/ml)
Standart 2 (10pg/ml)
Standart 1 (5pg/ml)
Sampel serum 1
Sampel serum 2
Sampel serum 1
Sampel serum 2
14
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
PENUNTUN [PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I
DAFTAR PUSTAKA
15
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK (DIV)
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM