Fajrin Noviyanto M.Sc.

,Apt
Praktikum bioteknologi
 Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan asam nukleat yang
mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan
biologis seluruh bentuk kehidupan selular.

Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan untuk memperoleh DNA
murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. DNA dapat
diisolasi dari berbagai sel yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam
inti sel. Beberapa sumber DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA
adalah urine, darah, rambut, gigi, kuku dan lainnya. Prinsip isolasi ada dua,
yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

Salah satu metode isolasi DNA yaitu dengan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR). PCR adalah teknik ilmiah dalam bidang molekular untuk
memperkuat tunggal atau beberapa salinan sepotong DNA di beberapa kali
lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA tertentu.
1. Memahami metode isolasi DNA

2. Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur,

dengan sampe DNA diambil dari sel epitel mulut

3. Memahami dan dapat melakukan teknik PCR pada

DNA manusia
 Metode isolasi DNA:

1.Teknik RADP
2.Teknik CTAB
3.Phenol chloroform
4.Salting out
5.Guanidine isothiocynate
6.Silica gel
7.PCR (polymerase Chain
Reaction)
Gosok pipi bagian dalam menggunakan batang kayu selama
kurang lebih 30 detik (penting: jangan ditelan)

Ambil minuman isotonik kumur-kumur dengan minuman isotonik

sebanyak 10 mL, sekaligus menggosok pipi selama 1 menit hasil
berkumur ini jangan ditelan, tapi dikeluarkan dalam beaker ini yang
menjadi larutan sel epitel yang akan diisolasi DNA nya.
 Atur temperatur 560C pada waterbath

Ambil 1,5 mL larutan sel epitelial menggunakan pipet

Mohr masukkan kedalam tabung mikrosentrifus

Masukkan tabung mikrosentrifus kedalam sentrifus selama 30 detik dengan

kecepatan 10.000 rpm dan gunakan sampel orang lain sebagai penyeimbang. Hasil
sentrifus yang didapat supernatan dibuang, kemudian tambahkan larutan sel nya
lagi

Langkah diatas ( diulang sebanyak 2 kali) agar endapan

(pelet) yang terbentuk semakin banyak
Kemudian tambahkan 1 mL buffer tris-EDTA kedalam tabung
mikrosentrifus

Tabung mikrosentrifus di vortex selama 30 detik (sampai endapan

hancur)

Selanjutnya tambahkan 50 mikroliter Proteinase K (enzim untuk

mencerna protein) dan masukkan dalam waterbath (560C) selama 10
menit.
Masukkan 100 mikroliter NaCl 2,5M kedalam tabung
mikrosentrifus aduk isi tabung agar tercampur baik,
dengan cara membolak-balikkan tabungnya.

Pindahkan semua isi tabung mikrosentrifus

ketabung lain yang bersih dan kering (hati-hati
agar tidak banyak muncul busa).

Pelan-pelan tambahkan 1 mL etanol dingin (untuk

mengendapkan atau menggumpalkan DNA) agar terlihat
batas jelas biarkan selama 5 menit
DNA akan menggumpal diantara batas buffer dan etanol
(terlihat seperti ada benang melayang berwarna putih)

Ambil DNA menggunakan batang kaca atau besi

taruh ditabung sentrifugasi kecil yang bersih (gunakan
tisue bersih untuk menghisap sisa etanol)

Simpan tabung mikrosentrifus kecil di lemari pendingin

pada suhu 00C
 Langkah pertama dalam isolasi DNA yaitu pengumpulan
sel-sel dengan cara menggosok pipi bagian dalam dengan batang
kayu sambil berkumur dengan minuman isotonik selama 1 menit.
Larutan kumur tadi dikeluarkan dalam beaker. Hasil dari berkumur
tersebut adalah larutan keruh yang merupakan campuran sel
epitel yang meluruh, sel bakteri dan mikroorganisme, serta protein
dan ion-ion yang disekresikan oleh kelenjar saliva yang terdapat
dalam rongga mulut. Ini yang akan menjadi larutan sel epitel yang
akan diiolasi DNAnya.
 Langkah selanjutnya dalam isolasi DNA yaitu pemecahan sel (lisis
sel) serta pencernaan protein. Langkah ini bertujuan untuk mengeluarkan isi
sel. Untuk mengisolasi DNA dari sel epitel mulut, sel epitel mulut harus
dilisiskan terlebih dahulu untuk memudahkan dalam isolasi DNA. Dengan
cara penambahan Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution). Larutan pelisis sel
(Cell Lysis Solution) sebenarnya bersifat sama sebagai bahan pengawet DNA
yaitu, deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan
pengawet DNA juga dapat mengurangi aktivitas DNA yang terdapat di dalam
sel.

Menurut Muladno (2002) Secara kimiawi penghancuran sel

tersebut dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim,
EDTA (etilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat).
 Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering
digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap
pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam
melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi
aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi
DNA.
Larutan sel epitel tadi dimasukkan ke dalam tabung
sentrifus sebanyak 1,5 ml dan disentrifugasi selama 30 detik
dengan kecepatan 10.000rpm. Hal ini bertujuan untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Supernatan
akan dibuang sedangkan pelet (endapan) akan diambil.
Sentrifugasi diulang sebanyak 2 x agar mendapatkan endapan
yang leboih banyak.
Kemudian ditambahkan 1 ml buffer tris EDTA. Fungsi
larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses
penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam
menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim
pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA.
 Selanjutnya divortex selama 30 detik sampai
endapannya hancur. Setelah itu ditambahkan 50 mikroliter
proteinase K dan dimasukkan dalam waterbath 56 derajat
celcius selama 10 menit. Fungsi dari proteinase K yaitu untuk
mencerna protein serta mendegradasi protein globular
maupun rantai polipeptida dalam komponen sel sehingga
tinggal DNA yang terdapat di dalam larutan tersebut
 Langkah terakhir yaitu pengendapan DNA. Langkah ini bertujuan
mendapatkan DNA murni. Dimasukkan 100 mikroliter NaCl 2,5M ke dalam
tabung mikrosentrifus. NaCl memegang peranan penting yaitu untuk
menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan
keduanya terpresipitasi (mengendap), NaCl juga digunakan untuk
malarutkan DNA karena ion Na+ yang dikandung mampu membentuk
ikatan fosfat DNA, sehingga pada saat Na+ membentuk ikatan fosfat DNA,
DNA akan berkumpul. Jadi NaCl disini selain untuk menghilangkan
karbohidrat dan protein, dan menjaga kestabilan pH NaCl juga membantu
proses pemekatan DNA.
Kemudian ditambahkan secara perlahan etanol dingin sebanyak 1
ml dan dibiarkan selama 5 menit agar terlihat batas yang jelas. Fungsi etanol
disini untuk pengikatan strand DNA yang telah berkumpul yang tadi telah
dipekatkan oleh NaCl, karena kerapatan etanol lebih kecil maka etanol akan
berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi, strand-strand DNA yang
terikat oleh etanol akan nampak seperti benang-benang putih yang
terapung diatas filtrat.
Pada dasarnya isolasi dan ekstraksi DNA adalah serangkaian
proses untuk memisahkan DNA dari komponen sel
lainnya. Proses tersebut meliputi tiga tahapan, yaitu:
pengumpulan sel, penghancuran sel dan penghilangan
protein dan RNA serta pengendapan DNA.
 Metode isolasi DNA: Prinsip Isolasi DNA ada 2:

1.Teknik RADP 1. Sentrifugasi, merupakan

2.Teknik CTAB teknik untuk memisahkan
3.Phenol chloroform campuran berdasarkan
4.Salting out berat molekulnya.
5.Guanidine isothiocynate 2. Presipitasi, merupakan
6.Silica gel langkah untuk
7.PCR (polymerase Chain mengendapkan suatu
Reaction) komponen dari campuran.
 Sebaiknya saat memanen sel dari sel epitel,
mulut dalam keadaan bersih dan saat menggosok
bagian dalam pipi harus tepat, jika tidak tepat
DNA tidak akan diperoleh.

Sebelum melakukan isolasi DNA, Sebaiknya praktikum isolasi DNA

sebaiknya praktikan mengetahui dilakukan secara aseptis agar tidak
fungsi alat dan bahan yang terjadinya kontaminasi terhadap
digunakan untuk isolasi DNA DNA
http://herisantoso89.blogspot.co.id/2010/10/isolasi-
dna-genom-manusia-dari-sampel.html

DAPUSNYA JUGA YA TOLONG SATU LAGI