ISOLASI DNA

Dian Riana Ningsih

DNA
Merupakan molekul yang amat panjang terdiri dari ribuan
deoksiribonukleotida yang bergabung dalam suatu urutan yang
bersifat khas bagi tiap organisme
Sel prokariot
Mengandung kromosom yang merupakan satu molekul DNA
yang berkaitan erat menjadi daerah inti atau nukleoid
Selain itu ditentukan DNA berukuran kecil berbentuk lingkaran
yang disebut dengan plasmid
Gambar. Unsur genetik bebas yang terdapat di dl sel bakteri

plasmid
Kromosom
bakteri

Sel eukariot
Mengandung lebih banyak DNA
DNA berukuran jauh lebih besar
DNA bergabung dengan protein menjadi serabut kromatin di dalam
nukleus (histon) yang dikelilingi oleh sistem membran ganda yang
bersifat kompleks
Masing-masing kromosom membawa serangkaian gen yang bersifat
unik
Gen : bagian dari kromosom yang menunjukkan spesifitas suatu sifat
tertentu
Jumlah kromosom normal pada berbagai spesies
- Organisme prokariot
- Bakteri

Organisme eukariot
-

Kucing
Mencit
Tikus
Kelinci
Manusia
Ayam

38
38
40
44
46
78

Pemurnian DNA dari Sel Hidup

Tiga macam DNA yang diperlukan oleh ahli rekayasa
1. DNA sel total
Sebagai sumber bahan untuk memperoleh gen yang akan diklon
Dapat berasal dari kultur sel bakteri, sel tanaman, sel hewan
2. DNA plasmid yang murni
Langkah-langkah dasar preparasi DNA plasmid sama dengan
pemurnian DNA sel total perbedaan : DNA plasmid harus
dipisahkan dari DNA kromosom yang juga terdapat bersama
dalam sel
3. DNA fag
Diperlukan jika vektor fag digunakan untuk kloning

Preparasi DNA Sel Total

Prosedur preparasi DNA totel dari kultur sel
bakteri :
1. Kultur bakteri ditumbuhkan kemudian dipanen
2. Sel dilisis untuk mendapat ekstrak kasar
3. DNA dimurnikan dari ekstrak kasar
4. Larutan DNA yang dihasilkan kemudian
dipekatkan

Preparasi DNA Sel Total

Menumbuhkan dan menanam kultur

bakteri
Medium untuk kultur harus memberikan campuran nutrien
penting yg seimbang pd konsentrasi yang
memungkinkan bakteri tumbuh dan membelah secara
efisien
Tabel: komposisi dua media khas untuk pertumbuhan
kultur bakteri
Komponen
g/l
1. medium M9
Na2HPO4
6,0
KH2PO4
3,0
NH4Cl
1,0
NaCl
0,5
MgSO4
0,5
Glukosa
2,0

2. medium LB (Luria-Bertani)

Tripton
Yeast ekstrak
NaCl

10 g/l
5 g/l
10 g/l

Medium M9 medium tertentu (defined medium)

semua komponennya diketahui

Medium LB medium kompleks (undefined) identitas
dan kuantitas komponen2 nya yang tepat tidak
diketahui
Tripton dan ekstrak ragi campuran senyawa kimia yang
tidak diketahui
Tripton asam amino dan peptida
Ekstrak ragi nitrogen, gula serta nutrien organik dan
anorganik

Dalam medium LB pada 37 C dengan

pengocokan pada kecepatan 150-250 rpm/
menit, sel E. coli akan membelah sekali setiap
20 menit sampai kultur mencapai densitas
maksimum kira-kira 2-3 x 109 sel/ml.
Pertumbuhan kultur dapat dimonitor dengan cara
pembacaan densitas optik pada panjang
gelombang 600 nm
Untuk E. coli 1 unit OD = 0,8 x 109 sel/ml
sentrifuge
Endapan sel

Preparasi Ekstrak Sel

Sel bakteri terbungkus dalam membran sitoplasma dan
dikelilingi oleh dinding sel yang kuat
Teknik-teknik untuk memecah dan membuka isi sel
bakteri :
1. cara fisik
Sel dipecah dengan kekuatan mekanis
2. cara kimiawi
Dilakukan dengan senyawa yang merusak dinding sel
dan senyawa lain yang merusak membran sel
Lisozim mendigesti senyawa polimetrik yang
menyebabkan kekakuan dinding
EDTA menghilangkan ion Mg yang penting untuk
mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel,
disamping dapat menghambat enzim-enzim selular
yang dapat merusak DNA
Detergen untuk mengganggu interaksi ionik antara
histon yang bermuatan positif dan tulang punggung
DNA yangg bermuatan negatif. Untuk menjamin
pemecahan kompleks DNA-protein

A. Lisis sel

Merusak dinding sel

Merusak membran sel

Ekstrak sel

B. Sentrifugasi untuk menghilangkan debris sel

DNA,
RNA,
protein
Debris sel

Sentrifugasi 8000
rpm, 10 menit

Pemurnian DNA dari ekstrak sel

Cara baku untuk menghilangkan protein dari ekstrak sel adalah dengan
penambahan fenol atau campuran fenol dan kloroform (1:1)
presipitasi protein tetapi DNA & RNA tetap berada dalam larutan

+ fenol

sentrifuge

Lapisan air (DNA +RNA)

Koagulasi protein
Fenol

Ekstrak sel
Proteinase K : memecah polipeptida
menjadi unit yang lebih kecil lebih
mudah dihilangkan

RNA dihilangkan dg
menambahkan enzim
nuklease sub unit
ribonukleotida

Pemekatan sampel DNA

A.

Etanol absolut ditambahkan pada lapisan atas larutan DNA

yang pekat. Serabut-serabut DNA dapat ditarik dengan
batang kaca

etanol
Serabut
DNA

Larutan DNA pekat

B Untuk larutan DNA encer, maka presipitat diperoleh dengan

sentrifugasi. (untuk 1 volume larutan DNA + 2,5 volume etanol
absolut). presipitat dilarutkan dengan H2O steril

etanol

Inkubasi semalaman suhu -15 oC

atau 15 menit suhu -70 oC.

Presipitat DNA dihasilkan dg sentrifugasi

Pengukuran DNA
Spektrofotometri UV
Banyaknya radiasi UV yang diserap oleh
larutan DNA ~ DNA dalam sampel
= 260 nm nilai nilai 1 = 50 g DNA
untai ganda / ml
Kemurnian : A 260 = 1,8
A 280

Sel bakteri
1. suspensi dalam EDTA
2. + lisozim, inkubasi
3. + 25 % SDS, panaskan
4. + NaCl
5. + CHCl3 penol
6. sentrifugasi pada 10.000 g
Lapisan organik
(bawah)

lapisan air
(atas)

protein pada antar permukaan

+ etanol 95 %
Lapisan air

DNA pada endapan

karakterisasipeartial dengan
spektro UV

Diagram alir isolasi DNA dari sel bakteri