Isolasi DNA Ikan

Oleh : Yuniar Mulyani

I. Pengambilan Sampel DNA

Jaringan yang banyak digunakan sebagai sumber DNA adalah : 1. Jaringan muda 2. Jaringan yang banyak mengandung DNA atau 3. Jaringan yang tidak mengakibatkan kerusakan/kematian induk 1. Jaringan muda Jaringan muda merupakan sumber yang baik untuk ekstraksi karena memiliki kandungan kontaminan polisakarida, polifenol dan metabolit sekunder yang sedikit. Jaringan dewasa yang banyak mengandung polisakarida dan metabolit sekunder sulit diekstraksi untuk mendapatkan DNA yang baik serta hasilnya tidak stabil untuk penyimpanan jangka waktu yang lama. Kemurnian DNA hasil isolasi menentukan hasil dan reproduksibilitas amplifikasi.

2. Jaringan yang banyak mengandung DNA Cth : Darah, daging, kelenjar 3. Jaringan yang tidak mengakibatkan kerusakan/kematian induk Cth : Sirip, sisik, akar rambut, Di lokasi pengambilan sampel, jaringan yang diambil, dibersihkan dari kotoran dengan menggunakan alkohol 70%. Jaringan disimpan dalam alkohol atau dimasukkan ke dalam plastik dan diberi es. Di laboratorium, setiap kantung disimpan di dalam lemari pendingin bersuhu -86C. Untuk ikan, sebaiknya dibawa ke laboratorium dlm keadaan hidup.

II. Isolasi dan Pemurnian DNA

Macam Isolasi DNA : 1. Isolasi DNA Genom 2. Isolasi DNA dari gel 3. Isolasi DNA plasmid

seluruh DNA organisme isolasi gen isolasi gen/DNA hasil kloning

1. Isolasi DNA genom Isolasi DNA secara umum mempunyai empat tahap yaitu : pemecahan sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, dan pencucian DNA Pemecahan sel dan Ekstraksi DNA Proses pemecahan sel dilakukan dengan penggerusan sampel yang dicampur ke dalam buffer ekstraksi. Proses ekstraksi DNA dilakukan untuk mengeluarkan DNA dari inti sel serta menghilangkan senyawasenyawa yang dapat mengkontaminasi DNA, senyawa tersebut antara lain : karbohidrat, lemak dan protein.

DNA dikeluarkan dari inti sel dengan bantuan Buffer Ekstraksi (TNE atau CTAB). EDTA berfungsi sebagai inhibitor nuklease karena kemampuannya dalam mengikat Ca2+ dan Mg2+. SDS berfungsi untuk memecah membran sel dengan cara melisis lapisan lemak dan mengikat protein. Proteinase K berfungsi untuk melisis protein dan memisahkan asam nukleat. Senyawa-senyawa yang dapat mengkontaminasi DNA dihilangkan dengan penambahan bahan kimia, seperti fenol : kloroform : isoamil alkohol (25 : 24 : 1). Campuran fenol dan kloroform berfungsi sebagai agen deproteinisasi yaitu memisahkan protein dari asam nukleat sedangkan isoamil alkohol bertindak sebagai agen anti busa. Dengan penambahan larutan tersebut maka akan terbentuk tiga fasa yaitu fasa organik yang mengandung pelarut organik, lapisan protein, dan fasa air yang mengandung asam nukleat.

Presipitasi DNA Polisakarida yang masih tersisa dapat dihilangkan dengan proses presipitasi atau pengendapan DNA. Presipitasi DNA dilakukan dengan menggunakan garam, antara lain dengan menggunakan ammonium asetat. Dalam proses presipitasi DNA biasanya disertakan dengan penambahan etanol, hal ini disebabkan karena asam nukleat akan mengendap karena sukar larut dalam etanol sedangkan pengotor seperti polisakarida dan sisa CTAB akan terikat dan larut dalam etanol.

Pencucian DNA Tahap akhir dari isolasi DNA ialah tahap pencucian DNA. Pencucian DNA dilakukan untuk memisahkan senyawa lain seperti larutan CTAB dan garam-garam yang ikut mengendap bersama DNA. Proses pencucian DNA dilakukan dengan penambahan etanol 70 %.

DNA yang telah melalui proses pencucian dilarutkan kedalam TE, yang berfungsi menjaga agar DNA tidak rusak. Kemudian Isolat DNA tersebut harus disimpan dalam keadaan dingin (-20oC)

III. Pengujian Isolat DNA

1.
2.

Spektrofotometri Elektroforesis

Mengukur kemurnian dan konsentrasi DNA dengan spektrofotometer. Kemurnian DNA dilihat dari nilai rasio A260/280 (R) sedangkan konsentrasi DNA ditunjukkan dengan nilai konsentrasi (C). Menurut Sambrook et al., (1998) hasil isolasi DNA dikatakan murni jika nilai rasio A260/280 antara 1,8 hingga 2,0. Melihat kemurnian dan konsentrasi DNA dengan Elektroforesis kualitas pita dan dibandingkan dg Marker

Metode Ekstraksi DNA total yang dikembangkan oleh Asahida, et.al. (1996) yang telah dimodifikasi
100 uL darah ikan,masukkan ke tabung polipropilene 1.5 mL 3 mL TNE buffer 1X 300 uL Tris-HCl 1 M 5 U Proteinase K 80 uL SDS 10%
nkubasi pada waterbath 37oC; 12 jam/ 50oC; 1.5 jam

+ NaCl 6 M 1/3-1/2 x vol lar

sentrifuga 3500 rpm; 25; RT ambil supernatan, + EtOH 100% 2-2.5 x vol
bolak-balik sampai presipitat jelas

sentrifuga 3500 rpm; 25; RT pelet dibilas EtOH 70% bbrp kali,keringkan pelet dilarutkan dlm TE 500 uL

ukur dg spektofotometri

elektroforesis agarosa 0.8%

2. Isolasi DNA dari gel

- Hasil

Amplifikasi dengan PCR - Hasil Elektroforesis terdapat lebih dari dua pita

3. Isolasi DNA plasmid

VEKTOR PEMBAWA PLASMID - Biasanya berasal dari bakteri - Komponen genetik ekstra kromosomal - DNA sirkuler tertutup - Bisa bereplikasi sendiri

Vektor kloning

Isolasi DNA Plasmid

Sesuai protokol dari Xiang, et.al. (1988)

koloni ditumbuhkan pada 4 ml Terrific Broth+ampisilin inkubasi 37oC; 250 rpm; semalam mikrosentrifuga 14 000 rpm; 20 supernatan buang, terbentuk pelet pelet dilarutkan dlm 100 l GTE, homogenasi tambahkan 200 l buffer lisis, homogenasi tambahkan 150 l 5 M potasium asetat, kocok sentrifuga 1, debris dibuang cuci dg etanol 95 % 2 x vol Pelet dikeringkan dg desikator, larutkan dalam 100 l deion steril

Tugas Bedah Jurnal Biotek

Buat kelompok yang terdiri dari 3-4 orang Cari Jurnal Internasional (> thn 2007); yang berhubungan dengan teknik yang dibahas dalam mk. bioteknologi perikanan a.l. Isolasi DNA/RNA, PCR, elektroforesis, marker DNA (RAPD,mikrosatelit, RFLP, 16S rRNA,dll), kloning gen, atau transfer gen. Objek : Organisme perairan, a.l. Mikroba (bakteri/virus), Ikan, Udang, dll. Dalam satu kelas tidak ada kelompok yang membahas jurnal yang sama (judul jurnal dikoordinir ketua kelas, dikumpulkan minggu depan) dan sudah di acc via e-mail ke : y_mulyaniag@yahoo.com Jurnal yang sudah di acc, diterjemahkan dan dibahas perkelompok, kemudian dikumpulkan pada saat UTS dalam bentuk makalah yang terdiri dari: Jurnal asli, Terjemahan jurnal, dan Pembahasan (dijilid plastik mika bening), dan softcopynya dikumpulkan dalam bentuk CD untuk 1 kelas.