PETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

Oleh Tim Asisten Praktikum Biologi Molekuler

LABORATORIUM GENETIKA FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2013

KATA PENGANTAR

Diktat petunjuk praktikum ini disusun guna membantu para mahasiswa Program Studi S1 Biologi Fakultas Biologi Unsoed dalam mempersiapkan, melaksanakan, dan menulis laporan hasil praktikum Biologi Molekuler. Materi acara yang diberikan disesuaikan dengan perkembangan fasilitas yang tersedia di Faklutas Biologi Unsoed. Segala saran dan kritik akan diterima dengan senang hati demi penyempurnaan mata acara dan petunjuk praktikum ini di masa mendatang. Semoga praktikum biologi molekuler yang dilaksanakan dapat memberikan pembekalan ketrampilan dasar bagi para mahasiswa yang pada suatu ketika akan melakukan penelitian di bidang biologi molekuler.

Purwokerto, April 2013 Penyusun

DAFTAR ISI

Halaman I. II. III. IV. V. ISOLASI DNA STRAWBERRY ISOLASI DNA KROMOSOM BAKTERI ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER BIOINFORMATIKA

ACARA I. ISOLASI DNA STRAWBERRY

LANDASAN TEORI Isolasi DNA secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan pembuanagn dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi. TUJUAN mengisolasi DNA kromosom buah mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom

BAHAN DAN ALAT 1. Buah 2. Deterjen cair 3. NaCl (garam dapur) 4. Etanol 5. Etanol 70% 6. Akuades 7. Tabung falcon 8. Tenderizer 9. Corong plastik/gelas 10. Pipet plastik 11. Sarung tangan 12. Saringan (kain) 13. Kamera Digital

CARA KERJA ISOLASI 1. Masukkan satu buah ke dalam kantung plastik. 2. Tambahkan 50 ml larutan ekstraksi (900 ml akuades, 100 mL deterjen, 2 sendok teh garam dapur) ke dalam kantung yang berisi buah. 3. Hancurkan buah dalam kantung plastik dengan cara meremas-remas. 4. Kemudian saring, tambahkan tenderizer dan masukan ke dalam tabung falcon. 5. Tambahkan etanol absolut dan amati kabut putih yang terbentuk.

HASIL Amatilah hasil isolasi DNA kromosom bakteri dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA kromosom yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.)

ACARA II ISOLASI DNA KROMOSOM BAKTERI LANDASAN TEORI Isolasi DNA kromosom secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan pembuanagn dindind sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingakt kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi.

TUJUAN mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom melakukan isolasi DNA kromosom bakteri E. coli

BAHAN DAN ALAT 1. Isolat cair E. coli 2. Mikrosentrifuga 3. Tabung mikrosentrifuga 4. Buffer TE 1x 5. Tenderizer 30% 6. Inkubator 7. Kloroform 8. Isopropanol 9. Alkohol 70% 10. Akuades 11. Sarung tangan 12. Seperangkat mikropipet beserta tipnya 13. Lemari pendingin (freezer) 14. Kertas tisu 15. Kamera Digital

CARA KERJA ISOLASI DNA BAKTERI 1. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi semalam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 3 menit. 2. Setelah disentrifugasi, tambahkan 1 ml buffer TE 1x ke dalam tabung tadi lalu dihomogenkan. 3. Lakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 3 menit. 4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri, kemudian pellet diresuspensi dengan 50 l tenderizer 30% dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam. 5. Setelah proses inkubasi, tambahkan 10 l SDS 10% lalu dihomogenkan dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. 6. Supernatan yang dihasilkan dipindah ke tabung mikrosentrifuga yang baru kemudian isopropanol dengan volume 1:1 dari volume supernatan kemudian diendapkan selama 7x24 jam dalam lemari pendingin (freezer). 7. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C 8. Supernatan dibuang dan pellet diresuspensi dengan 1 ml alkohol 70% kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 10000 selama 10 menit. 9. Supernatan dibuang kembali, tabung dikeringkan, ditambah 50 l TE 1x dan diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri.

HASIL Amatilah hasil isolasi DNA kromosom bakteri dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA kromosom yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.)

ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LANDASAN TEORI Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmenfragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

TUJUAN Melakukan cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT 1. DNA marker, misalnya DNA yang dipotong dengan HindIII 2. Sampel DNA, misalnya : a. DNA kromosom bakteri, b. DNA kromosom buah 3. Agarosa 4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 5. Akuades 6. Gelas Ukur 1000 ml 7. Labu Erlenmeyer 50 ml 8. Tabung mikrosentrifuga

9. Sarung tangan 10. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 11. Kertas parafilm 12. seperangkat alat elektroforesis 13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) 14. larutan Etidium Bromid (EtBr) 15. UV transluminator 16. Kaca mata UV 17. kamera digital

CARA KERJA 1. Buat 500 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 10 ml TAE 50x ke dalam 490 ml akuades. 2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,6 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 60 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. 3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki) 4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki 5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-600C, tambahkan 1 l etidium bromid (PERINGATAN karsinogenik). 6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. 8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat

10. masukkan 10 l sampel DNA dan 2 l loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. 11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. 12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). 13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 100 V dan 40 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. 14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. 15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). 17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

HASIL Dokumentasikan pita-pita DNA hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan

membandingkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker.

ACARA IV PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

LANDASAN TEORI

Molekul hayati dan bahan kimia seperti asam nukleat, protein, fenol, dan karbohidrat mampu menyerap sinar ultra violet (UV). Namun, zat-zat tersebut memiliki nilai serapan (absorbansi) cahaya tertinggi pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Asam nukleat, baik DNA maupun RNA, menyerap sinar UV dengan nilai absorbansi tertinggi pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein memiliki nilai absorbansi tertinggi pada panjang gelombang 280 nm. Kemikalia yang digunakan dalam isolasi asam nukleat seperti alkohol, kloroform, dan guanidin, atau pun karbohidrat dan materi organik lain yang umumnya terdapat pada sel tanaman menyerap sinar UV dengan nilai absorbansi teringgi pada panjang gelombang 230 nm. Sementara itu, panjang gelombang 320 nm sering digunakan untuk mengukur kekeruhan larutan asam nukleat dan berfungsi sebagai faktor koreksi, khususnya dalam penentuan kuantitas asam nukleat menggunakan spektrofotometer. Kuantitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas konsentrasinya, yang merupakan hasil kali nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dengan faktor pengenceran dan nilai konsensi. Nilai konsensi untuk DNA untai ganda (dsDNA) adalah 50 ng/L (50 g/mL) untuk tiap unit absorbansi pada 260 nm, sedangkan nilai konsensi untuk RNA atau DNA untai tunggal (ssDNA) adalah 40 ng/L (40 g/mL) untuk tiap unit absorbansi pada 260 nm. Secara umum pengukuran

konsentrasi asam nukleat dirumuskan sebagai berikut.

[DNA]ng/L = (A260-A320) 50 ng/L x F(faktor pengenceran) [RNA]ng/L = (A260-A320) 40 ng/L x F(faktor pengenceran)

Sementara itu, kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya. Untuk DNA, kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai

perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1,8. Bila nilai perbandingan tersebut lebih rendah dari 1,8, dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein. Sebaliknya, bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1,8, dikatakan bahwa

DNA terkontaminasi oleh RNA. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada

panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2,2, dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni. Namun, bila nilai tersebut lebih rendah dari 2, dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat, materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi.

Sebaliknya, jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2,2, hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan.

TUJUAN 1. Melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi

2. Mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh

ALAT DAN BAHAN

1. Spektrofotometer

UV

(dalam

praktikum

ini

digunakan

UV-VIS

Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240) 2. Akuades steril 3. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri 4. Tissue 5. Pipet tetes

CARA KERJA 1. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil.

2. Sebanyak 10 L DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3.000 L akuades,

kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm, dan 320 nm.
3. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus

untuk menghitung konsentrasi DNA.

4. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein, lakukan pembagian nilai

absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm.

5. Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia, lakukan

pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm. 6. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri. Apakah terdapat perbedaan nilai, baik tingkat kemurnian maupun konsentrasi? Jelaskan alasannya.

ACARA V BIOINFORMATIKA
LANDASAN TEORI

Bioinformatika

merupakan

pemanfaatan

teknologi

informasi

dalam

menyimpan, mengolah, dan menginterpretasikan data biologi molekuler. Oleh karenanya, bioinformatika merupakan gabungan antara ilmu biologi, komputer, dan statistika. Melalui perhitungan secara statistik dan pemodelan yang telah dikaji secara komprehensif dapat dilakukan penggambaran dan simulasi data tingkat

kemiripan urutan (sekuens) nukleotida, asam amino, sampai dengan pola ikatan dan reaksi kimia (metabolomik). Suatu urutan DNA hasil sekuensing dapat diketahui kemiripannya dengan urutan DNA yang tersimpan dalam pangkalan data melalui teknik bioinformatika. Bahkan, dari urutan DNA yang ada dapat diketahui petra restriksi sehingga diperoleh informasi enzim restriksi apa saja yang mampu memotong urutan DNA tersebut untuk kepentingan diagnosis atau pun rekayasa genetika. Selain itu, dengan bioinformatika perancangan primer untuk mendeteksi keberadaan suatu gen pada spesies tertentu juga dapat dilakukan menggunakan berbagai jenis piranti lunak yang tersedia.
TUJUAN 1. Melakukan penjajaran (alignment) data hasil sekuensing DNA

2. Membuat peta restriksi 3. Melakukan perancangan primer

ALAT DAN BAHAN

1. Urutan-urutan DNA hasil sekuensing 2. Program of line BIOEDIT.

3. Program-progam on line BLAST (www. ncbi.nlm.nih.gov), program PRIMER3

(http://www.idtdna.com/SciTools/), NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter), dan

IDT Oligo Analyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/Oligo Analyzer/)

CARA KERJA

A. Penjajaran DNA dengan Data DNA di GenBank (harus terhubung dengan internet) 1. Kunjungi website GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. 2. Pilih BLASTn. 3. File hasil sekuens dicopy-paste (data berupa satu sekuens DNA disediakan oleh asisten dan sudah diberi nama sesuai dengan nama praktikan). 4. Klik run BLAST. 5. Hasil BLAST akan muncul berupa nama-nama gen berikut kode aksesnya yang memiliki kemiripan dengan sekuens yang dianalisis. 6. Sekuens dikatakan tepat sama dengan salah satu data di GenBank apabila nilai Max idintity 100% dan nilai E value adalah 0. Jika nilai Max identity tertinggi kurang dari 95%, hal ini menandakan bahwa sekuens yang dianalisis merupakan sekuens baru (bisa didaftarkan di GenBank). 7. Ambillah tiga sekuens yang memiliki nilai Max identity tertinggi dan simpanlah dalam notepad dengan format fasta (Format fasta dicirikan oleh adanya tanda > disertai nama sekuens dan urutan basa pada baris berikutnya) seperti contoh berikut.

B. Mendeteksi Situs-situs Restriksi 1. Kunjungi website NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter). 2. Pindahkan data hasil sekuens di notepad dengan format fasta. 3. Pilih Linier dan pilih juga All commercially available specifities. 4. Klik SUBMIT. 5. Data analisis bisa ditunggu atau bisa dikirim lewat e-mail. 6. Hasilnya akan nampak sebagai mistar yang melambangkan urutan DNA dengan garis-garis yang memotong mistar dengan kode-kode enzim restriksi.

7. Untuk mengetahui daftar enzim apa saja dan memotong pada urutan berapa, klik List 1 cutter , dan setelah tampil daftarnya, ubahlah menu sort order ke cut position. 8. Hasilnya akan tampil sebagai urutan enzim berdasarkan posisi pemotongannya. Simpanlah data peta restriksi, baik dalam bentuk skema garis maupun tabel daftar enzim.

C. Merancang Primer (Harus tersambung dengan internet) 1. Bukalah program BIOEDIT. 2. Bukalah data sekuens dalam format fasta pada BIOEDIT. 3. Blok semua data yang tampil di layar BIOEDIT, lalu aktifkan program penjajaran (alignment) dengan mengeklik CLUSTAL W. 4. Hasil Clustal W dicari urutan basa yang sama dengan bantuan penanda. 5. Daerah yang urutannya sama lalu diblok dan satu sekuens yang mewakili daerah tersebut dicopy paste di note pad dan disimpan dengan nama yang lain (misal: daerah konserv gen X). 6. Kunjungi website PRIMER3 (http://tools.neb.com/NEBcutter). 7. Masukkan sekuens gen dengan format fasta. 8. Tentukan parameternya berupa panjang primer 20 basa panjang fragmen yang teramplifikasi 400-500 basa kandungan GC 60% suhu annealing 55C 9. Kemudian klik SUBMIT. 10. Hasilnya berupa rancangan primer. 11. Primer hasil rancangan diuji kualitasnya dengan mengunjungi IDT Oligo Analyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/). 12. Rancangan primer juga diuji spesifitasnya dengan BLASTn.

Catatan: Rancangan primer yang baik akan menunjukkan spesifitas yang tinggi saat di BLASTn. Artinya, rancangan primer tersebut memiliki E Value 0 dan Max Identity 100. Rancangan primer yang baik selanjutnya dapat digunakan sebagai dasar untuk

membuat primer dengan cara mengirimkan rancangan tersebut pembuatan primer.

ke perusahaan

Pertanyaan: 1. Setelah Anda melakukan praktikum ini, apakah Anda tahu nama asli sekuens yang Anda analisis dan apa alasannya? 2. Agar sekuens DNA dapata disisipkan ke vektor tanpa terpotong sedikit pun, maka enzim komersial apa saja yang tidak boleh Anda pakai? 3. Untuk mendeteksi keberadaan gen tersebut pada suatu organisme dengan metode PCR, primer apa yang sebaiknya digunakan, dan kondisi PCR seperti apa yang sebaiknya dipakai, lalu berapa ukuran pita yang dikehendaki? Apa alasannya?