LAPORAN PRAKTIKUM

MK BIOTEKNOLOGI TANAMAN III

Judul

KELAS E

Kelompok 3

Siti Syadiah 150510140045

Imas Komalasari 150510140101

Eva Oktaviani 150510140101

Mustika Arsri 150510140101

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS PADJADJARAN

MEI, 2016
 KATA PENGANTAR

Rasa syukur yang dalam kami sampaikan ke hadiran Tuhan Yang Maha Pengsih, karena
berkat rahmat dan hidayah-Nya laporan praktikum ini dapat diselesaikan sesuai yang diharapkan.
Laporan praktikum ini membahas tentang “Isolasi DNA Tanaman, Uji Kualitas DNA dengan
Elektroforesis, dan PCR”.
Laporan praktikum ini dibuat dalam rangka memenuhi salah satu tugas mata kuliah
Bioteknoligi Pertanian. Kami ucapkan banyak terimakasih kepada Ibu Dr. Ir. Neni Rostini, MS.,
selaku dosen yang membimbing kami selama perkuliahan dikelas. Tak lupa juga kami ucapkan
terimakasih kepada Ibu Santika Sari, S.P., M.P yang telah membimbing kami selama praktikum
dan Ceu Afni selaku asisten dosen yang banyak membantu kami. Terimakasih juga kepada
teman-teman yang telah banyak mebantu dalam menyelesaikan laporan praktikum ini baik
bantuan pemikiran maupun materi.
Kritikan dan saran akan kami terima untuk memperbaiki laporan praktikum ini. Semoga
laporan praktikum ini dapat bermanfaat bagi siapapun yang membacanya.
Demikian makalah ini kami buat semoga bermanfaat.

Jatinangor, Mei 2016

Penyusun

i|Laporan Praktikum Kelompok 3 Bioteknologi Pertanian

 DAFTAR ISI

Table of Contents
KATA PENGANTAR ..................................................................................................................... i

DAFTAR ISI................................................................................................................................... ii

ii | L a p o r a n P r a k t i k u m K e l o m p o k 3 B i o t e k n o l o g i P e r t a n i a n
BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

1.1. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk memahami dan mempraktekkan beberapa kegiatan yang
terkait dengan upaya penerapan bioteknologi tanaman khususnya dalam proses isolasi DNA
genom, PCR (Polymerase Chain Reaction), elektroforesis, dan visualisasi DNA

BAB II BAHAN DAN ALAT PERCOBAAN

2.1 Isolasi DNA
Alat : pipet, pipet tip, mortar steril, tabung mikro 2 mL, waterbath, tabung mikro 1,5 mL, tabung
sentrifugasi, spidol, stopwatch, spatula, tissue, pestel, gunting
Bahan : 10% SDS, larutan CTAB 900 μL, 100mM Tris-Cl (pH 8.0), 20 mM EDTA (pH 8.0), 1.4
M NaCl, CIA, isopropanol, chloroform, ethanol 70%, buffer TE, sampel daun wortel, biji padi
dan buah pisang, alcohol 70%
Cara kerja : 1) mensterilisasi alat-alat isolasi (mortar, pestel, spatula, dan gunting) dengan
menggunakan alkohol 70%, 2) mengeringkan dengan menggunakan tissue, 3) sampel dipotong kecil-
kecil sebanyak kurang lebih 0,5 gram dalam mortal, 4) sampel digerus dalam mortar steril yang
diberi bufer ekstraksi sebanyak 1000 μL, yang terdiri dari larutan CTAB 900 μL dan larutan SDS
100 μL, 5) hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL, 6) kemudian diinkubasi di
dalam waterbath pada suhu 65oC selama 15 menit sambil dilakukan pengocokan perlahan setiap
lima menit, pemurnian DNA dilakukan melalui penambahan CIA (cloroform : isoamil alkohol =
24 : 1) sebanyak 700 μL ke dalam tabung, 7) kemudian dikocok hingga merata, suspensi lalu

1|Laporan Praktikum Kelompok 3 Bioteknologi Pertanian

disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit, selanjutnya supernatan diambil dan
dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml, 8) pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan
isopropanol sebanyak 700 μL ke dalam supernatan dan dicampur perlahan, 9) sampel disentrifugasi
pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit, 10) pelet yang diperoleh dicuci dengan 10 μL etanol
70%, kemudian didiamkan selama 30 menit dalam suhu ruang, 11) campuran disentrifugasi kembali
selama 5 menit pada kecepatan 10000 rpm suhu 4oC, 12) pelet selanjutnya dikering anginkan pada
suhu ruangan selama 24 jam hingga alkohol mengering, 13) pelet yang telah kering dilarutkan
dalam bufer TE yang mengandung ribonuklease sebanyak 100 μL dan didiamkan pada suhu 4°C
selama satu hari sebelum digunakan untuk kegiatan selanjutnya.
2.2 Uji Kualitas DNA Menggunakan Elektroforesis
Alat : sumur (well), tray elektroforesis, tengki elektroforesis
Bahan : gel agarose, gel poliakrilamida, larutan 0,5xTBE buffer, aquades steril, 1 µl loading
dye, mesin UV transumilator
Cara kerja : 1 Pembuatan agarose : 1) melakukan pertimbangkan ukuran PCR product, 2)
membuat 0,8 % gel agarose dengan volume total 100 ml. Timbang agarose sebanyak 1 gr, 3)
memasukan agarose ke dalam labu erlemeyer lalu ditambahkan 0,5x TBE buffer yaitu sebanyak
100 ml, mengaduk kemudian memasukan kedalam microwave selama 10 menit atau sampai
agarose larut (sampai sudah tidak terlihat adanya gumpalan agarose), 4) jika gel agarose sudah
dingin menuangkan ke dalam tray elektroforesis, 5) memasang sisirnya dan membiarkan
agarose sampai memadat, sesudah padat cabut perlahan-lahan sisirnya. 2 Pengisian tangki
elektroforesis : 1) menyiapkan 0,5x TBE buffer dengan volume total 2000 ml, lalu memasukan
200 ml 5x TBE buffer ke dalam tabung erlemeyer lalu ditambahkan aquades steril hingga
volum mencapai 2.000 ml, lalu memasukan ke dalam tangki elektroforesis, 2) kemudian
memasang tray yang berisi gel agarose ke dalam tangki elektroforesis. 3 Loading DNA ke
sumur elektroforesis dan Running Elektroforesis : 1) membersihkan sumur gel agarose
dengan menggunakan siringe, 2) loading sampel 6 μl hasil PCR ditambahkan 1 μl loading dye ke
dalam sumur gel agarose, 3) merunning elektroforesis pada 90 volt selama 60 menit.

2.3 Uji Kuantifikasi dan Kualitas DNA Menggunakan Spectrophotometer

Alat : spektrofotometer (Rayleigh UV-9200), 2 buah UV cuvette, blank cuvette, lampu UV
Bahan : DNA template hasil isolasi, larutan TE buffer

2|Laporan Praktikum Kelompok 3 Bioteknologi Pertanian

Cara kerja : 1) menghidupkan (switch on) spectrophotometer (Rayleigh UV-9200)
melalui saklar on/off yang ada di samping kanan alat, 2) mengatur panjang gelombang yang
digunakan, jika memakai panjang gelombang antara 190-350 nm maka lampu UV dihidupkan
melalui saklar on/off di sebelah kiri alat, 3) memanaskan (warming up) mesin
Spectrophotometer selama 30 menit, 4) menyiapkan 2 buah UV cuvette, blank cuvette, DNA
template hasil isolasi, dan larutan TE buffer, 5) UV cuvette pertama diisi dengan larutan TE
buffer sebanyak 2000 μL, sedangkan UV cuvette kedua diisi dengan campuran 20 μL DNA
sampel dan 1980 μL TE buffer (dilusi 1 : 100), 6) setelah mesin selesai pemanasan,
memasukkan ketiga cuvette ke dalam jalur cuvette secara berurutan, misal : (1) blank cuvette;
(2) UV cuvette berisi TE buffer; (3) UV cuvette berisi DNA, 7) memosisikan blank cuvette sejajar
dengan lampu UV lalu tekan tombol 0%, menunggu hingga layar menunjukkan angka T = 0%,
8) memosisikan UV cuvette (TE buffer) sejajar dengan lampu UV lalu tekan tombol 100% dan
menunggu hingga layar menunjukkan angka T = 100%, 9) melakukan langkah 7 dan 8
berulang-ulang, hingga angka pada layar stabil, 10) jika sudah stabil, posisikan UV cuvette
berisi DNA di depan lampu UV dan mencatat nilai T (Transmittance) dan A (Absorbance).

2.4 PCR
Alat : Pipet, pipet tip, stopwatch, mesin PCR atau termocycler machine,
Bahan : template (DNA), primer F, primer R, KAPA 2G FastReady Mix, air (milli Q water),
PCR buffer, dNTP, DNA template, enzim DNA polymerase (taq polymerase/taq pol)
Cara kerja : 1) menyiapkan komponen yang dibutuhkan yaitu nuclease free water, template
DNA, primer F, primer R, KAPA 2G FastReady Mix, 2) mencampurkan semua komponen yang
dibuat kedalam tabung sesuai urutan, 3) setelah semuanya tercampur, mikrotabung
disentrifugasi dalam waktu singkat sekitar 1 menit, 4) memasukkan sampel dalam mesin PCR,
5) mengatur program PCR yang akan digunakan

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

BAB IV KESIMPULAN

3|Laporan Praktikum Kelompok 3 Bioteknologi Pertanian

 DAFTAR PUSTAKA

4|Laporan Praktikum Kelompok 3 Bioteknologi Pertanian

5|Laporan Praktikum Kelompok 3 Bioteknologi Pertanian