BIOTEKNOLOGI

BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM

Bagus Herwibawa, S.P., M.P.

Dr. Ir. Florentina Kusmiyati, M.Sc.
Prof. Dr. Ir. Syaiful Anwar, M.Si.

PROGRAM STUDI S-1 AGROEKOTEKNOLOGI

DEPARTEMEN PERTANIAN
FAKULTAS PETERNAKAN DAN PERTANIAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2019

i
 DAFTAR ISI

Halaman

Tata Tertib Praktikum................................................................................................... 1

Acara 1. Isolasi DNA.................................................................................................... 2
Acara 2. Uji Kualitatif dan Kuantitatif......................................................................... 5
Acara 3. Amplifikasi DNA........................................................................................... 6

ii
 Tata Tertib Praktikum

1. Praktikan diwajibkan mengikuti seluruh rangkaian kegiatan praktikum.

2. Praktikan yang berhalangan hadir diwajibkan mengajukan permohonan tertulis yang
disampaikan kepada asisten.
3. Praktikan datang ke laboratorium sekurang-kurangnya 15 menit sebelum kegiatan
praktikuum dimulai.
4. Praktikan yang datang terlambat tanpa pemberitahuan lebih dari 15 menit, tidak diijinkan
untuk mengikuti kegiatan praktikum.
5. Praktikan wajib menggunakan pakaian laboratorium (jas lab), serta berpakaian rapih dan
sopan
6. Praktikan dilarang makan dan minum serta meninggalkan laboratorium tanpa seijin dosen
atau asisten
7. Praktikan wajib mengisi worksheet untuk setiap pekerjaan yang dilakukan
8. Praktikan wajib menyerahkan worksheet kepada asisten pendamping praktikum diakhir
kegiatan praktikum setiap harinya.

1
 ACARA I
ISOLASI DNA

Bahan : sampel daun tanaman kedelai, β-ME, buffer GP1, buffer GP2, chloroform, buffer
GD, ethanol absolute, buffer PW, buffer TE
Alat : mortar, alu, eppendorf tube, waterbath, sentrifuse, spin column CB3, vortex,
micropipet

Cara Kerja

2
3
4
 ACARA II

UJI KUANTITATIF DAN KUALITATIF

Bahan : sampel DNA, buffer TE, gel agarose, buffer TAE, NFW, Loading dye
Alat : white tip, nano drop, computer, geldoc, alat elektroforesis, sisir
Cara Kerja

UJI KUANTITATIF SAMPEL DNA DENGAN NANO DROP

1. Siapkan sampel DNA, Micropipet ukuran 10 µl, white tip sejumlah sampel, nano drop,
computer.
2. Hidupkan nano drop dan computer.
3. Ambil DNA sampel 1 µl dan teteskan pada NanoDrop.
4. Lihat kuantifikasi A260/280.

UJI KUALITATIF
ELEKTROFORESIS

1. Membuat agarose gel dengan kosentrasi 1,5% yaitu dengan mencampurkan buffer
TAE 100x dengan volume 100 ml dan agarose sebanyak 1,5 g, kemudian aduk hingga
homogen.
2. Memasukan larutan agarose dan buffer TAE ke dalam oven dengan suhu medium
selama 5 menit.
3. Agarose yang telah mencair ditunggu hingga hangat kuku, apabila menggunakan gel
stain kemudian diberikan sebanyak 1 ul per 10 ml larutan agarose.
4. Larutan agarose dituangkan kedalam cetakan yang telah dipasangkan sisir/comb
dengan ukuran whell/sumuran tertentu
5. Gel agarose yang telah mengeras dimasukkan kedalam alat elektroforesis dan pastikan
telah terisi buffer TAE 100x hingga menyelimuti gel agarose.
6. Membuat loading DNA Ladder dengan komposisi 2 ul DNA Ladder dan 3 ul NFW
serta 1 ul Loading dye. Loading DNA Ladder dimasukan kedalam sumuran.
7. Membuat loading sampel dengan komposisi 1 ul Loading dye dan 5 ul sampel,
kemudian dimasukan kedalam sumuran.
8. Setting alat elektroforesis dengan daya 100 v selama 45 menit. Pastikan alat tertutup
rapat dan semua kabel telah terhubung.
9. Gel agarose kemudian dimasukan kedalam GelDoc dan diamati dibawah penyinaran
UV, tekan tombol auto agar secara otomatis mencari eksposur yang tepat.
10. Potret citra yang telah terbentuk didalam GelDoc dan simpan sebagai data.

5
 ACARA III

AMPLIFIKASI DNA

Bahan : primer SS, NFW, WS, sampel DNA

Alat : vortex, sentrifuse, PCR, eppendorf tube, PCR tube
Cara Kerja

PEMBUATAN PRIMER WORKING SOLUTION

DAN PENGENCERAN DNA

1. Siapkan primer (dari pabrik dalam bentuk lyophilized primer / kering beku), NFW, PCR
tube.
2. Spindown primer
3. Lihat Technical Data Sheet (TDS), tambahkan NFW sesuai TDS sehingga mendapat
konsentrasi 100µM
4. Tambahkan NFW sesuai TDS
5. Vortex selama 2 menit
6. Spindown
7. Ambil 15 µl primer Stock Solution (SS) masukkan ke PCR tube
8. Tambahkan 85 µl NFW ke PCR tube (working solution / WS dengan konsentrasi 15
µM)
9. Beri label dengan pena permanen
10. Vortex selama 10 detik
11. Spindown
12. Simpan SS dan WS di freezer
13. Siapkan sampel DNA dan eppendorf tube
14. Lihat hasil kuantifikasi NanoDrop
15. Tambahkan NFW (sehingga konsentrasi 15ng/µl)
16. Beri label

6
 PEMBUATAN MASTER MIX DAN PCR MIX

1. Siapkan AmpliTaq, Enhancer, NFW, PCR tube, micropipet lengkap, tip lengkap,
2. Siapkan eppendorf tube sesuai 2 x sampel, dan PCR tube sejumlah sampel
3. Masukkan AmpliTaq 12,5 µl ; Enhancer 1 µl ; NFW 8,5 µl kedalam PCR tube
4. Vortex selama 10 detik
5. Masukkan eppendorf tube
6. Spindown
7. Keluarkan PCR tube dari eppendorf tube
8. Masukkan primer 1 µl dan DNA 2 µl ke dalam PCR tube
9. Vortex 10 detik
10. Masukkan eppendorf tube
11. Spindown
12. Simpan pada suhu hingg membeku
13. Persiapan PCR

AMPLIFIKASI DNA / PCR

1. Setting program PCR (untuk sample tanaman kedelai)

Pre denaturasi : 940 C ; 10 menit
Denaturasi : 940 C ; 30 detik
Annealing : 380 C ; 1 menit
Extention : 720 C ; 2 menit
Siklus : 45 siklus
Final extention : 720 C ; 8 menit
Hold 40 C

2. Buka penutup mesin PCR

3. Tempatkan PCR tube selang-seling
4. Tutup penutup mesin PCR
5. Tekan start