LAPORAN PRAKTIKUM BIOMEDIK

Nama : Amalia Putri

NIM : P07134219003

A. Judul : Pemeriksaan PCR DNA

B. Tujuan : Mengisolasi DNA dari sel-sel epithelial mulut.

C. Alat & Bahan : 1. Alat :

 Tabung reaksi dengan tutup
 Tabung mikrosentrifuge
 Mikropipet 100-1000 μl
 Mikropipet 10-100 μl
 Mikropipet 2-20 μl
 Tabung PCR
 Rak tabung PCR
2. Bahan :
 NaCl 0,9%
 Instagene Mix
 PCR Master Mix
 DNA Control Sampel
 DNA Loading Dye (Pewarna)
 1X TAE Buffer Solution

D. Prosedur Kerja : Tahap 1 (Isolasi DNA)

1) Disiapkan 2 tabung reaksi dengan tutup, 1 tabung diisi dengan 3
ml NaCl 0,9% dan tabung sisanya diisi dengan Instagene mix.
2) Untuk pengampilan sampel, gigit bagian dalam pipi selama 10
detik dengan perlahan, hati-hati jangan sampai berdarah dan
jangan mengonsumsi makanan sebelum pengambilan sampel.
3) Dimasukkan 3 ml Nacl 0,9% ke dalam mulut dan dikumur-
kumurkan selama 30 detik. Kemudian cairan NaCl 0,9% tadi
 dimasukkan kembali ke dalam tabung, dapat dimasukkan ke
dalam beaker glass terlebuh dahulu untuk lebih mudah.
4) Dengan mikropipet ambil 1 ml larutan tadi, lalu dimasukkan
dalam tabung mikrosentrifuge untuk dilakukan sentrifugasi
selama 5 menit dengan kecepatan maksimal.
5) Dibuang supernathan dengan mikropipet, hati-hati jangan
sampai mengambil dendapan karena terdapat cell pallet yang
akan digunakan sebagai sampel, disisakan sedikit cairan NaCl,
kemudiandihomogenkan kembali
6) Pada tabung mikrosentrifuge yang baru, dipipet 200μl Instagene
mix dan 20μl larutan sampel dan NaCl 0,9%, dihomogenkan.
7) Diletakkan pada wayterbath suhu 56°C selama 5 menit.
8) Diambil tabung dan dihomogenkan, kemudian diletakkan
kembali pada waterbath selama 5 menit.
9) Diambil kembali tabung, dan dihomogenkan.
10) Diletakkan tabung ke dalam waterbath dengan suhu 100°C
selama 5 menit untuk melisiskan sel agar dapat mengeluarkan
DNA.
11) Diambil tabung tadi, lalu disentrifuge selama 5 menit dengan
kecepatan maksimal. Jika sudah, sampel dapat digunakan untuk
tahap kedua atau dapat disimpan pada pendingin untuk
disimpan.

Tahap 2 (Amplifikasi DNA)

1) Disiapkan tabung PCR dan diberi label.
2) Diambil 20μlsupernathan dari sampel tahap 1 lalu dimasukkan
ke dalam tabung PCR, hati-hati jangan sampai mempipet
endapan Instagene matrix karena dapat mempengaruhi reaksi.
3) Ditambahkan 20μlPCR Master Mix ke dalam tabung PCR yang
sama, dan dihomogenkan.
4) Diletakkan tabung PCR ke dalam PCR Cycler .
5) Pastikan memilih program PCR yang benar, kemudian tekan
tombol “RUN” untuk mrenjalankan alat PCR Cycler.
6) Proses ini akan berlangsung selama 3 jam untuk 35-40 siklus.
 7) Setelsh program selesai, diambil tabung PCR, sampel ini dapat
digunakan untuk tahap 3, ataupun disimpan terlebih dahulu di
pendingin.

Tahap 3 (Elektroforesis Gel)

a. Cara pembuatan gel
1. 1X TBE ( larutan yang disiapkan untuk 1000 ml ). 10,8
gr Tris, 5,5 gr asam borik, dan 0,7 gr EDTA dimasukkan
ke dalam beaker glass 100 ml. Ditambahkan 900 ml
aquadest dan diaduk dengan magnetic strirrer sampai
larut. Kemudian, ditambahkan aquadest sampai volume
larutan 1 liter.
2. 1 gr agarose dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml
yang bersih. Ditambahkan 125 ml larutan 1 X TBE
Buffer solution. Dipanaskan hingga mendidih dan larutan
menjadi jernih. Kemudian dinginkan di water bath
hingga suhu 60°C. Disiapkan casting tray, dipasang satu
“comb” (sisir) pada pertengahan “tray” (plat cetakan)
dan satu sisir lagi pada ujungnya. Dituang 40ml 0,8%
agarose ke casting tray.

b. Cara kerja alat elektroforesis:

1) Ditunggu hingga gel beku, lalu dilepaskan comb secara
hati-hati.
2) Diletakkan gel di dalam elektroforesis tank yang sudah
berisi larutan 1X TBE.
3) Ditambahkan larutan 1X TBE secukupnya sampai gel-gel
tenggelam seluruhnya.
4) Untuk mewarnai DNA sampel, dicampur 10μl DNA
sampel dengan 10μl perwarna DNA (loading dye) di atas
parafilm dan langsung dimasukan semuanya (20μl) ke
sumur gel.
5) Dinyalakan mesin elektroforesis selama 30 menit dengan
tegangan 90V. Sampel akan mulai bergerak ke katode,
 (DNA bermuatan negatif)
6) Dimatikan mesin elektroforesis secara sempurna.
7) Dengan sangat hati-hati dikeluarkan gel dan diletakan
pada tray yang disediakan..
8) Pindahkan ke alat “UV reader” supaya hasilnya lebih
jelas lagi.

E. Pembahasan : Pada penggunaan agar-agar untuk eletroforesis agarose, agar-agar

yang digunakan tidak boleh terlalu panas saat dituang ke dalam
cetakan karena jika terlalu panas dapat mengakibatkan retaknya
cetakan, tapi juga tidak boleh terlalu dingin karena agar-agar akan
mengeras dan tidak dapat menjadi sumur. Pada saat menuangkan
agar-agar ke dalam cetakan, tidak boleh ada gelembung udara. Pada
saat melakukan elektroforesis tahap pertama yang dilakukan adalah
mengisi masing masing sumur, dimana setiap agar-agar harus diisi
dengan marker, negatif dan sampel. Setelah 14 marker, negatif dan
sampel DNA diisi pada setiap sumur, arus dijalankan pada
elektroforesis. Adanya arus dapat diketahui dari gelembung gas yang
keluar dan arus berlangsung dari positif ke negatif. Hasil
elektroforesis, band DNA dari sel epitel tidak begitu jelas ataupun
tidak muncul. Hal ini dapat disebabkan oleh pengambilan sampel
DNA dari sel epitel yang kurang teliti, mungkin pada saat menggigit
bagian dalam pipi tidak tepat atau pada saat memperoleh endapan,
pengerjaannya kurang teiti. Selain itu, harus diperhatikan
penyimpanan larutan-larutan tertentu, ada yang harus pada
temperature -20°C (Primer, dNTP’s, Buffer, Taq dan bila perlu
larutan DNA), oleh karena itu pada saat bekerja harus diletakan pada
tempat yang dingin atau menggunakan es batu sebagai alas.
Dan,pastikan selalu menggunakan tabung dan tip yang telah
disterilisasi agar tidak terjadi kontaminasi untuk menghindari hasil
yang tidak diingikan.

F. Kesimpulan : Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam
 pengerjaan analisis DNA metode PCR. Kualitas secara keseluruhan,
akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi
secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang
dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas
tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan
metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan
(termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan
bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak
Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali
dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat
digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan
kali hanya dalam beberapa jam. Elektroforesis adalah teknik
laboratorium untuk memisahkan molekul bermuatan. "Gel" merujuk
pada matriks yang digunakan untuk memisahkan molekulnya. Prinsip
Dasar Electroforesis berhubungan dengan gaya gerak Iistrik yang
digunakan untuk mendorong atau menarik molekul melalui matriks
gel.

G. Daftar Pustaka :https://www.youtube.com/watch?v=Uvyv9STONSY&feature=youtu.be

https://www.youtube.com/watch?v=JKUo4QV7emo&feature=youtu.be
https://www.youtube.com/watch?v=kjJ56z1HeAc&feature=youtu.be
https://s3-us-west-2.amazonaws.com/oww-files-
public/c/cb/LAPORAN_PRATIKUM_5.pdf
https://s3-us-west-2.amazonaws.com/oww-files-
public/9/97/Lap._Praktikum_Isolasi_DNA_dan_PCR.pdf
https://www.academia.edu/9271245/laporan_PCR