LAPORAN PRAKTIKUM II BIOKIMIA

BLOCK EMBRIOLOGY GENETICS

Nama : TIARA SAFIRA CINDY

NPM : 2308260113
Kelompok : 3 B1
Tanggal Praktikum : 1-Desember-2023

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SUMATERA UTARA
2023
 PRAKTIKUM II
PCR (POLYMERASE CHAI REACTION)
1. TUJUAN PRAKTIKUM
Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa diharapkan mengenal dan mampu
mengidentifikasi serta melakukan pemeriksaan DNA manusia dengan menggunakan alat
PCR.

2. LANDASAN TEORI
Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu
metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali
dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. Amplifikas DNA pada PCR dapat
dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA
suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA.
PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya
primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan)
yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan dan berasal dari patogen yang terdapat
dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari
bakteri termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel
pada ujung 3’ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi
aktivasi polimerase. (1)
PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim
polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses
pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali
replikasi DNA dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh
enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat
reponsif dengan perubahan suhu dan mesin thermal cycler, suatu mesin yang mampu
menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-bahan untuk membuat reaksi
PCR. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara
enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan
dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik
lain yang menggunakan DNA. (2)
 Tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat, penempelan
(annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Denaturasi merupakan
proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi
cetakan (templat) sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA
polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-95°C selama beberapa menit.
Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut:
1).Denaturasi.
 Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai
tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan
putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen.Pada tahap ini,
seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang
sebelumnya.Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90oC – 95oC.
2).PenempelanPrimer.
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang
spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan
hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat.
Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC – 60oC. Selanjutnya, DNA
polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat
kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi
selanjutnya misalnya pada 72oC. 3).
3.) Reaksi Polimerisasi (Extension)
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu
72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi
3‟nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA
polimerase.

Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer
akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda),
sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n
adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1
copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy,
sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan
seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR
dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan
menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3‟ dari potongan DNA yang
dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan
vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujungujung 5‟-nya.Proses PCR
dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler. (2)

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE

Elektroforesis merupakan suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada

pergerakan molekul-molekul bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik).
Pergerakan molekul dalam dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, dan
besar muatan dari molekul. Metode pemisahan Gel Electrophoresis System adalah
salah satu metode yang murah dan mudah dikembangkan. Metode ini biasanya
digunakan untuk pemisahan DNA dan protein.
Elektroforesis melalui gel agarosa atau akrilamid merupakan teknik
pemisahan yang sederhana, cepat dan tepat memisahkan molekul yang diinginkan[5].
 Jenis elektroforesis gel yang lain adalah Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS (SDS-
PAGE) yang merupakan sebuah metode elektroforesis untuk pemisahan protein
berdasarkan berat molekul. Teknik ini dilakukan dalam gel poliakrilamid yang
mengandung sodiumdodecyl sulphate (SDS). SDS adalah sebuah detergen anionik
untuk menyelubungi molekul protein. (3)

3. PROSEDUR KERJA
3.1 Alat dan Bahan:
1. Gotaq green master mix ( Buffer, dntps, mgCl2, Taq Polymerase)
2. Primer
3. Nucleus Free water
4. DNA
5. Thermal Cycler

3.2 Cara kerja

 Pemeriksaan PCR angiotensin-converting enzyme (ACE) gene
Cara kerja :
Untuk Volume 1 reaksi adalah 25 µl, yang terdiri dari:
1 reaksi PCR MIX
Komponen (µl) 10 reaksi 20 reaksi
(x10) (x20)
Go Taq Green 12,5 125 250
Master Mix
Primer upstream 0.5 5 10
Primer downstream 0.5 5 10
Nucleus Free water 9.5 95 190
Volume total PCR 23 230 460
Mix
DNA template 2 Diambil terlebih dahulu
Total Volume pada 25 sebanyak 23 µl dari Larutan
1 tabung reaksi PCR mix. Kemudian masing-
masing reaksi ditambahkan
dengan DNA template
sebanyak 2µl sehingga volume
akhir 1 reaksi tetap 25 µl.

LALU MASUKKAN KE DALAM ALAT PCR (THERMAL CYCLER) DAN JALANKAN SESUAI
PROSEDUR.

INITIAL DENATURATION 980C 2 MINUTE

31 CYCLES  STEPS: 980C 15 SECONDS, 580C 1 MINUTE, 750C 30
SECONDS
POST RUN 750C 5 MINUTES
POST HOLD 40C

CARA KERJA PEMBUATAN GEL ELEKTROFORESIS

1. Menyiapkan casting tray masing-masing. Pasang satu “comb” (sisir) pada

pertengahan “tray” (plat cetakan) dan satu sisir lagi pada ujungnya.
2. 2 g agarose dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang bersih. Tambahkan
100 ml larutan 1X TAE buffer solution.
3. Tutup flask/beaker dengan foil aluminium untuk mengurangi penguapan dan
sisakan celah sedikit.
4. Aduk dan panaskan sampai mendidih dan larutan jernih.
5. Dinginkan sampai ~60˚ dan tambahkan 2,8μL larutan Gel Red.
6. Tuangkan ke casting tray

Cara kerja alat elektroforesis:

1. Bila gel sudah beku, lepaskan comb secara hati-hati.
2. Letakkan gel di dalam elektroforesis tank yang sudah berisi larutan 1X TAE.
Tambahkan larutan 1X TAE secukupnya sampai gel-gel terbenam seluruhnya.
3. Gunakan mikropipet untuk menghisap 7μL sampel DNA dan secara hati-hati
masukkan ke dalam “well”/sumur tertentu. Pada saat memasukkannya, pastikan
ujung dari tip sudah sedikit masuk pada lubang well gel elektroforesis. Catat
posisi dan urutan sampel grup Anda pada halaman hasil praktikum ini.
4. Siapkan plastik parafilm, teteskan 2μL loading dye di atas plastic parafilm
sebanyak 2 tetes. Pipetkan 5μL larutan marker, teteskan di atas tetesan pertama,
kemudian dengan tip miropipet masih menempel pada kedua campuran tetesan
tersebut, pipet berulang kali hingga homogen. Dengan menggunakan pipet yang
sama, hisap campuran tersebut dan masukkan campuran tersebut ke dalam
well pertama dari kiri dan kanan gel elektroforesis
5. Nyalakan mesin elektroforesis selama 45 menit dengan tegangan 100V 150 mA.
Sampel-sampelnya akan mulai bergerak ke katode (DNA bermuatan negatif)
6. Matikan mesin elektroforesis secara sempurna.
7. Dengan sangat hati-hati keluarkan gel dan letakan pada tray yang disediakan.
Pindahkan ke alat “UV reader” supaya hasilnya lebih jelas lagi. Foto hasilnya.
4, HASIL
Terlihat pita DNA pada ukuran 490 bp

5. KESIMPULAN
Genotype dari gen ACE pada sampel DNA yang diperiksa adalah I I
 DAFTAR PUSTAKA
1. Marmiroli N, Maestri E. Polymerase Chain Reaction (PCR). Food Toxicants Anal Tech
Strateg Dev. 2007;5(6):147–87.
2. Hasibuan E. Karya tulis ilmiah ini telah disetujui oleh Kepala LaboratoriumTerpadu
Kultur Sel dan Jaringan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Karya tulis Ilm
ini telah disetujui oleh Kepala Lab Kult Sel dan Jar Fak Kedokt Univ Sumatera Utara.
2015;1–17.
3. Rohmana A, Fuad M, Ulfin I, Kurniawan F. Penggunaan Agar-agar Komersial sebagai
Media Gel Elektroforesis Pada Zat Warna Remazol: Pengaruh Komposisi Buffer, pH
Buffer dan Konsentrasi Media. J Sains Dan Seni Its . 2016;5(2):130–3.
LAPORAN SEMENTARA
v
 DOKUMENTASI
 PCR

 ELEKTROFORESIS
