LAPORAN INQUIRY BASED LEARNING

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Ditujukan untuk memenuhi nilai mata kuliah Bioteknologi Pertanian

Oleh:
Zachra Aghnia Faza
150510180192
Kelas C

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2020
 PENDAHULUAN

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan sebuah teknik yang ditemukan oleh Mullis
pada tahun 1983 dan dipatenkan pada tahun 1985. PCR terjadi secara in vitro yang
memungkinkan sintesis enzimatis dalam jumlah besar (amplifikasi) dari wilayah target DNA
secara eksponensial. DNA disintesis dengan cara yang sama seperti yang terlihat in vivo (di
sel) menggunakan DNA polimerase. PCR dapat menghasilkan puluhan miliar salinan
fragmen DNA dari hasil ekstraksi DNA.

PCR adalah teknik yang banyak digunakan yang telah meningkatkan kemampuan kita untuk
menganalisis gen. DNA genom yang ada di dalam sel mengandung ribuan gen. Hal ini yang
membuatnya sulit untuk diisolasi dan menganalisis gen individu apa pun. PCR
memungkinkan sekuens DNA tertentu, biasanya sesuai dengan gen/bagian gen, untuk disalin
dari DNA genom dalam reaksi enzim sederhana. Satu-satunya persyaratan adalah bahwa
beberapa urutan DNA di kedua ujung daerah yang akan disalin itu diketahui. DNA yang
sesuai dengan urutan yang diinginkan disalin/diperkuat oleh PCR lebih dari satu juta kali
lipat dan menjadi molekul DNA utama dalam reaksi. DNA yang cukup diperoleh untuk
analisis rinci atau manipulasi gen yang diperkuat.

Beberapa komponen penting yang ada di dalam metode PCR ini adalah:

1) DNA template
2) Primer oligonukleotida
3) DNA polymerase yang tahan panas, dapat digunakan pada proses denaturasi pada
suhu 94-95°C
4) Deoxynucleoside triphosphate (dNTP), biasanya menggunakan dCTP (Deoxycytidine
triphosphate), dTTP (Deoxythymidine triphosphate), dATP (Deoxyadenosine
triphosphate, dan dGTP (Deoxyguanosine triphosphate). dNTP bertindak sebagai
building block DNA yang diperlukan dalam ekstensi DNA.
5) Kation divalen, biasanya menggunakan ion Mg+2 dari MgCl2, yang bertindak sebagai
kofaktor (menstimulasi aktivitas DNA polimerase).
6) Larutan penyangga (buffer) untuk menjaga kadar pH. Ada dua jenis buffer dalam
PCR, yaitu “Low-salt buffer” (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan “High-salt
buffer” (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Untuk panjang DNA target antara 0-5
 kilobasa biasanya diperlukan “low-salt buffer” sedangkan untuk panjangDNA target
lebih besar dari lima kilobasa digunakan “high-salt buffer”.
7) Kation monovalen, biasanya menggunakan 50mM HCl untuk amplifikasi segmen
DNA yang panjangnya lebih dari 500 pasang basa.
8) Penggunaan dimetil sulfoksida (DMSO) sebagai buffer dalam Taq polymerase

Faktor-faktor untuk mendukung hasil PCR yang optimal adalah:

 Jenis polimerase DNA
 Konsentrasi dNTPs, MgCl2, dan polimerase DNA
 Suhu
 Buffer PCR
 Waktu
Tahapan proses PCR:
 Denaturasi
Dalam PCR yang dikatalisis oleh Taq polimerase, terjadi denaturasi pada suhu 94-95
ºC, yang merupakan suhu tertinggi enzim dapat bertahan selama 30 atau lebih siklus
tanpa mengalami kerusakan. Pada siklus pertama, terjadi denaturasi selama 5 menit
untuk memastikan denaturasi lengkap dari molekul panjang DNA template.

Gambar: Denaturasi. Sumber: Ehtisham et al.

 Annealing
Suhu pada proses annealing antara 55-65°C tergantung dari sekuens primernya dan
panjangnya. Suhu annealing dapat dioptimalkan dengan cara melakukan percobaan
PCR pada suhu kamar antara 2-100°C di bawah suhu leleh primer oligonukleotida.

Gambar:
Annealing.
Sumber:
Ehtisham et al.
 Extension
DNA polimerase mengkatalisis pemanjangan (extension) primer oligonukleotida dan
adanya untai baru, memiliki sekuens yang melengkapi untai templat yang disintesis.
Suhu optimal untuk sintesis DNA mungkin sedikit berbeda tergantung pada DNA
polimerase yang digunakan. Ketika Taq polimerase digunakan, suhu ideal untuk
sintesis DNA adalah sekitar 72-78 ºC. Pada suhu tersebut, Taq polimerase dapat
memasukkan sekitar 2000 nukleotida setiap menit.

Gambar: Pemanjangan. Sumber: Ehtisham et al.

 PROSEDUR PEMBUATAN COCKTAIL (MIX PCR REAGENTS)
(Sumber: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/)

Cara Kerja:
1. DNA yang sudah diisolasi selanjutnya dimasukkan kedalam tabung khusus PCR. PCR
bekerja dengan memanaskan dan mendinginkan larutan berulang-ulang sehingga
tabung PCR dirancang untuk distribusi panas yang merata.
2. Lalu tambahkan primer 1 kedalam tabung PCR. Primer menempel pada situs pada
untaian DNA yang berada di kedua ujung segmen yang ingin disalin. Primer
merupakan alat yang ampuh untuk menyalin urutan DNA yang sangat spesifik karena
hampir tidak ada kemungkinan akan menargetkan situs yang salah. Kemudian
tambahkan primer 2 yang akan menempel pada situs kedua.
3. Tambahkan nukleotid pada tabung PCR. Nukleotid yang berupa Adenin (A), Guanin
(G), Sitosin (C), dan Timin (T), yang dapat menyalin milyaran DNA.
4. Terakhir tambahkan polimerase DNA kedalam tabung PCR. Polimerase DNA dapat
membaca kode DNA dan menempelkan nukleotida yang sesuai untuk membuat
salinan DNA. DNA polimerase telah dipilih secara khusus untuk menahan panas
tinggi dari reaksi PCR.
5. Simpan tabung PCR kedalam DNA Thermal Cycler. Alat ini dapat mengatur suhu
(menaikkan atau menurunkan suhu) pada waktu tertentu. Perubahan suhu ini sangat
penting untuk membuat reaksinya bekerja.
 PROSEDUR PCR UNTUK MENDETEKSI PADI GMO

Bahan dan Metode

Persiapan sampel
- Varietas GM (Jagung Bt 11 & Kedelai Roundup Ready)
- Sampel benih padi (500 g x 81 sampel)
Isolasi dan kualifikasi DNA
Sampel benih dan sumber GM dihaluskan dengan penggiling listrik. DNA genom diekstraksi
dari semua sampel menggunakan kit Ekstraksi DNA sesuai dengan instruksi, beberapa
penyesuaian juga digunakan untuk meningkatkan kualitas DNA. Lalu 100 mg bubuk
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf bersih yang mengandung 300 μl penyangga lisis. 20
μl proteinase K ditambahkan ke dalam campuran dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu
60°C. Setelah inkubasi, 580 μl buffer pengikat ditambahkan ke dalam tabung, dicampur
dengan vortex dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70°C, kemudian disentrifugasi
selama 1 menit dengan 8000 × g dan supernatan dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5
ml yang bersih. Menempatkan kolom spin (A) dalam tabung Eppendorf 1,5 ml dan kemudian
supernatan diaplikasikan ke kolom spin (A) dan disentrifugasi pada 8000×g selama 1 menit,
angkat kolom (A), kemudian 440 μl etanol (100%) ditambahkan ke dalam larutan dan
dilanjutkan dengan diaplikasikan ke dalam spin kolom B baru dan disentrifugasi pada 8000×g
selama 1 menit. Setelah sentrifugasi, 500 μl buffer pencuci ditambahkan ke kolom B dan
disentrifugasi pada 8000×g selama 3 menit untuk menghilangkan etanol sepenuhnya. Setelah
di cuci, tabung berisi infiltrate dibuang. Menempatkan kolom spin B dalam tabung Eppendorf
bersih dan menambahkan buffer elusi 35–50 μl yang dipanaskan sebelumnya hingga 70°C ke
kolom, diinkubasi pada suhu kamar selama 3 menit, kemudian disentrifugasi pada 8000×g
selama 1 menit. Solusi diperoleh, disimpan pada -20°C sebelum penyaringan.

Kemurnian dan kualitas DNA yang diisolasi adalah langkah utama untuk efisiensi PCR.
Konsentrasi dan kemurnian DNA yang diekstraksi dievaluasi dengan absorpsi ultraviolet
(UV) pada panjang gelombang 260 nm dan 260/280 nm menggunakan spektrofotometer.
Primer Oligonukleotida (Sumber: Safaei et al.)

PCR
Analisis PCR dilakukan di thermal cycler. Reaksi amplifikasi mengandung 2 μl DNA genom
dan campuran reaksi PCR yang sesuai. Campuran reaksi PCR termasuk: 12 μl campuran
master PCR siap pakai 2 × (Komposisi: Tris-Hcl pH 8,5, (NH4) 2SO4, 3 mM Mgcl2, 0,2%
Tween 20, 0,4 mM dNTPs, 0,2 unit / μl Ampliqon Taq DNA polimerase, pewarna dan
penstabil merah inert), 1 μl setiap primer, dan 9 μl air suling ion bebas steril. Konsentrasi
primer untuk semua gen target adalah 0,1 μl. Akhirnya, tes PCR dilakukan dalam volume 25
μl. Kondisi reaksi PCR adalah sebagai berikut:
- Untuk SPS: denaturasi awal pada 94°C selama 5 menit, amplifikasi pada 94°C selama
30 detik, anil pada 58°C selama 45 detik, ekstensi pada 72°C selama 75 detik, dan
perpanjangan akhir selama 8 menit pada suhu 72°C.
- Untuk GM03/GM04: denaturasi awal pada 94°C selama 5 menit, amplifikasi pada
94°C selama 1 menit, anil pada 60°C selama 40 detik, dan perpanjangan akhir selama
8 menit pada 72°C.
- Untuk IVR1-F/IVR1-R: denaturasi awal pada 94°C selama 5 menit, amplifikasi pada
94°C selama 1 menit, anil pada 64°C selama 40 detik, dan perpanjangan akhir selama
8 menit pada 72°C.
- Untuk P35S-cf3/P35S-cf4 dan HA-nos-118f / HA-nos-118r: denaturasi awal pada
94°C selama 5 menit, amplifikasi pada 94°C selama 1 menit, anil pada 60°C selama
40 detik, dan perpanjangan akhir selama 8 menit pada suhu 72°C.
 HASIL PCR MENGGUNAKAN ENZIM TAQ POLYMERASE & PHUSION
POLYMERASE
(Sumber: http://virtual-pcr.ico2s.org/pcr/)

TAQ POLYMERASE

PHUSION POLYMERASE
 DAFTAR PUSTAKA

Ehtisham, Mohammad & Wani, Firdous & Wani, Iram & Nissar, Sheeba. 2016.
Polymerase Chain Reaction (PCR): Back to Basics. Indian Journal of Contemporary
Dentistry. 4. 30-35. 10.5958/2320-5962.2016.00030.9.
Handoyo, D., Rudiretna, A. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Unitas, Vol. 9 (1), 17-29.
Kadri, K. 2019. Polymerase Chain Reaction (PCR): Principle and Applications.
Synthetic Biology - New Interdisciplinary Science.

Safaei, Payam & Molaee, Ebrahim & Khaniki, Gh & Afshari, Setareh & Rezaie,
Sassan. 2019. A simple and accurate PCR method for detection of genetically modified rice.
Journal of Environmental Health Science and Engineering. 17. 1-5. 10.1007/s40201-019-
00401-x.