Polymerase Chain Reaction (PCR)

OLEH
KELOMPOK III
 KELOMPOK III

ADERIA ANGRIAWAN (N012231014)

DZULFIANA ASHAN (N012231019)
MUH. ARFANDY GUNAWAN (N012231029)
MUH. HARYANDI (N012231031)
Table of
Content

• Definisi PCR • Jenis Jenis PCR

• Konsep Dasar PCR • Definisi Gel Elektroforesis
• Manfaat PCR • Prinsip Kerja Elektroforesis
• Komponen PCR • Metode Kerja (Alat Dan Bahan)
• Metode PCR • Peran PCR Dan Elektroforesis
 Definisi PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR)

merupakan suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik
PCR dapat digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA dalam
jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa
jam
 Konsep Dasar PCR
• Reaksi berantai polymerase adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in
vitro
• Amplifikas DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut
amplimers
• Primer DNA suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA
PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA (20-30 nukleotida)
• DNA template yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan dan berasal dari patogen yang terdapat
dalam spesimen klinik
• Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung 3’ primer ketika proses pemanjangan
dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polimerase
 Manfaat PCR

• Uji Diagnostik Kesehatan

• Penelitian Genetika
• Analisis Keturunan dan
Keanekaragaman Genetik
• Pemantauan Lingkungan
• Penelitian Kanker dan Penyakit Genetik
• Pendidikan & Penelitian
 Komponen PCR

DNA Cetakan Primer Nukleotida

DNA Polymerase Buffer PCR Tube

 Komponen PCR
• DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan
diamplifikasi. DNA cetakan yang digunakan
sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul.
• Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen
oligonukleotida pendek (18 – 28 basa
nukleotida) yang digunakan untuk mengawali
sintesis rantai DNA. Dan mempunyai
kandungan G + C sebesar 50 – 60%.
• Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri
dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP. dNTP
mengikat ion Mg2+ sehingga dapat
mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang
diperlukan untuk reaksi polimerasi.
• Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis
reaksi sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari
Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini
diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim
polimerase taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang yang
akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan
meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder.
• Buffer, larutan buffer PCR umumnya mengandung 10 – 50mM
Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20ᵒ C); 50 mM KCl; 0,1% gelatin
atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak
0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%;
disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.
• PCR tube, wadah untuk menyimpan sampel DNA sebagai
tempat untuk menggabungkan semua komponen yang
diperlukan untuk amplifikasi DNA targetan

Denaturasi
Pada proses PCR, dilakukan denaturasi awal
sebelum enzim Taq polimerase ditambahkan
ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA
adalah proses pembukaan DNA untai ganda
menjadi DNA untai tunggal. Biasanya
diperlukan waktu sekitar 3 menit untuk
memastikan bahwa molekul DNA didenaturasi
menjadi DNA beruntai tunggal. Denaturasi
yang tidak sempurna menyebabkan replikasi
DNA yang cepat (reformasi DNA untai
ganda), sehingga menyebabkan kegagalan
proses PCR. Waktu denaturasi yang terlalu
lama dapat menurunkan aktivitas enzim Taq
polimerase. Aktivitas enzim mempunyai
waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit dan 5
menit pada suhu 92,5; 95 dan 97,5°C.
Metode PCR
Anneling
Kriteria yang umum digunakan untuk
merancang primer yang baik adalah primer
tersebut harus mengandung 18-25 basa,
mengandung 50-60% G+C dan kedua primer
tersebut harus identik. Urutan DNA dari
masing-masing primer itu sendiri juga tidak
boleh saling melengkapi karena akan
membentuk struktur sekunder pada primer
dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu
hibridisasi yang umum digunakan pada PCR
adalah 30 hingga 45 detik. Semakin panjang
dimensi primernya, semakin tinggi suhunya.
Kisaran suhu ikatan yang digunakan adalah
dari 36°C hingga 72°C, tetapi suhu tipikal
adalah dari 50°C hingga 60°C.
Extention
Pada langkah ini, Taq polimerase memulai
aktivitas ekstensi DNA primernya dari
ujung 3'. Laju perakitan nukleotida enzim
ini pada suhu 72°C diperkirakan antara 35
dan 100 nukleotida/detik, bergantung pada
buffer, pH, konsentrasi garam, dan
molekul DNA target. Jadi, untuk produk
PCR dengan panjang 2000 pasangan basa,
1 menit sudah lebih dari cukup untuk
langkah ekstensi primer ini. Biasanya,
pada akhir siklus PCR, waktu yang
dihabiskan untuk langkah ini diperpanjang
menjadi 5 menit sehingga semua produk
PCR diharapkan membentuk DNA
beruntai ganda.
 Jenis-Jenis PCR

Real Time PCR Nested PCR Inverse PCR

Metode ini digunakan untuk Nested-PCR, proses ini Metode ini digunakan
memperkuat, mengisolasi atau mengurangi kontaminasi ketika hanya satu urutan
mengurutkan RNA dari sel atau produk selama amplifikasi internal yang diketahui.
jaringan. Metode ini didukung karena penggabungan
oleh reverse transkriptase (yang primer yang tidak
mengubah RNA menjadi cDNA), diperlukan.
yang melibatkan pemetaan dan
penjelasan kapan dan di mana
gen diekspresikan
 Jenis-Jenis PCR
Kuantitatif PCR
PCR kuantitatif; digunakan
untuk mengukur hasil produk
PCR dalam rangkap dua.
Metode ini digunakan secara
tidak langsung untuk
mengukur besaran, mulai dari
jumlah DNA, cDNA atau
RNA. Hasil dari metode ini
juga menunjukkan salinan
sampel.
Asimetri PCR Touchdown PCR
Asimetri digunakan untuk Touchdown PCR adalah
memperkuat satu untai DNA varian PCR yang
agar lebih asli dibandingkan mengurangi anil primer
yang lain. Metode ini nonspesifik dengan
digunakan dalam jenis studi menurunkan suhu anil
pengurutan dan hibridisasi antar siklus.
tertentu, yang idealnya hanya
satu dari dua komponen yang
saling melengkapi.
 Definisi Elektroforesis

Elektroforesis merupakan teknik

untuk memisahkan fragmen DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul)
dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan adalah agarosa.
Elektroforesis gel agarosa dapat
dilakukan untuk memisahkan sampel
DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga 20.000 pasang basa (bp).
 PRINSIP KERJA ELEKTROFORESIS

Partikel
bermuatan
negatif (anion) NOTE:
akan bergerak
menuju kutub . Makin kecil ukuran molekulnya
maka makin cepat laju migrasinya,
Prinsip kerja positif karena matriks gel mengandung
berdasarkan jaringan kompleks berupa pori-pori
sehingga partikel-partikel tersebut
pergerakan dari dapat bergerak melalui matriks.
muatan partikel Partikel
bermuatan
positif (kation) Ukuran fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan
akan bergerak laju migrasinya dengan laju migrasi
menuju kutub fragmen-fragmen molekul DNA
standar (DNA ladder) yang telah
negatif diketahui ukurannya.
 Alat-Alat Teknik PCR

(a) (b) (c)

Ket:
(a) PCR thermal cycler
(b)Agarose gel electrophoresis equipment
(c) Micropipettors
(d) Aerosol barrier micropipettor tips
(d) (e) (f) (e) Sterile 1.5-ml microcentrifuge tubes
(f) 0.2-ml thin-walled PCR tubes (or plates)
 Bahan Teknik PCR
• Template DNA
• Primers
• dNTPs (100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• Thermostable DNA polymerase (e.g., Taq polymerase or a high
fidelity enzyme)
• 10x PCR buffer
• Tris base
• Hydrochloric acid (HCl)

• Ammonium sulfate [(NH4)2SO4]

• Tween-20
• Magnesium chloride (MgCl2)Agarose
• 50x TAE buffer
• Ethidium bromide
• 6x DNA gel loading dye
Buffer:
Step 1 10_ PCR buffer
 Alat-alat Elektroforesis
• Tabung Eppendorf,
• Mikropipet,
• Mortat,
• Tabung Erlenmeyer,
• Gelas Ukur,
• Penangas Air (Dengan Suhu 80°C),
• Magnetic Stirrer,
• Magnectic Bar,
• Sentrifuga,
• Pinset,
• Timbangan,
• Pompa Vacum,
• Cetakan Gel 20 X 16 X 1 Cm3 ,
• Timer,

• Meja Pendingin,
• Pembungkus Plastik,
• Freezer,
• Kawat Halus Untuk Memotong Gel,
 Bahan Teknik Elektroforesis
Bahan kimia yang digunakan, tergantung dari hewan atau tumbuhan
enzim apa yang akan diuji. Seperti misalnya larutan pengekstra yang
digunakan untuk jenis udang-udangan berdasarkan DICKSON dkk,
(1983) adalah menggunakan sistem enzim Esterase (EST), dan Malat
dehidrogenase (MDH). WIKNESWARI (1995) menggunakan Malik
Enzim (ME), serta CHELIAK & PITEL (1984) menggunakan Phosphat
glukosa isomerase (PGI) dan lain sebagainya. Untuk menentukan sistem
enzim tersebut sebelumnya dilakukan uji optimalisasi terlebih dahulu
terhadap hewan yang akan diujikan.
 Peran/Aplikasi PCR & Elektroforesis
PCR
PCR digital telah digunakan dalam
berbagai aplikasi dalam diagnostik kanker yang
mencakup deteksi mutasi langka, analisis nomor
salinan, khususnya untuk HER2 dan EGFR,
serta kuantisasi absolut. Selain itu, telah banyak
digunakan dalam identifikasi mikrobiologi dan
kuantifikasi bakteri dan virus. PCR digital juga
dapat pengujian DNA janin tanpa sel untuk
kelainan gen tunggal yang diturunkan dari pihak
ayah.
Elektroforesis
Differences
Metode elektroforesis banyak
dilakukan untuk pengamatan taksonomi,
sistematik dan genetik serta untuk
mengindentifikasi spesies hewan maupun
tumbuhan (bio-sistematik). Dapat pula
digunakan untuk melihat phylogenetic
recon-struction (rekonstruksi secara
Filogenetik) dari suatu jenis hewan atau
tumbuhan.
 DAFTAR PUSTAKA
Canene Adams Kirstie., 2013. General PCR. Johns Hopkins University School of Medicine: USA.Vol. 529.

Handoyo, D. and Rudiretna, A., 2000. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1), pp.17-29.

Nugraha Fadel, Dkk. (2014). Analisis Sebagian Sekuen Gen Ferritin2 pada Padi (Oryza sativa L.) Indragiri Hilir, Riau. Journal of Biology &

Biology Education. Biologi Dept., Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Riau University, Indonesia

Pratiwi Rianta., 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Puslitbang Oseanologi-LIPI: Jakarta. Vol. 26. No.01.

Rahman, M.T., Uddin, M.S., Sultana, R., Moue, A. and Setu, M., 2013. Polymerase Chain Reaction (PCR): a short review. Anwer Khan Modern

Medical College Journal, 4 (1).

Rajyalakshmi Luthra et al., 2016. Clinical Applications of PCR, Methods in Molecular Biology, Springer Science & Business Media, Vol. 13.

Setyawati, R., dan Zubaidah, 2021, Optimasi Konsentrasi Primer dan Suhu Annealing dalam MendeteksiGen Leptin pada Sapi Peranakan

Ongole (PO) Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR), Indonesian Journal of Laboratory, Vol. 4 (1).

Yusuf, Z.K., 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR), Jurnal Saintek, 5 (6).