BIOLOGI MOLEKULER

MUSYARRAFAH

BAGIAN BIOKIMIA
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ISLAM AL-AZHAR
MATARAM
INFORMASI HERIDITER
Satu sel  motor untuk informasi genetik dalam menghasilkan suatu spesies
INFORMASI HERIDITER
Satu sel  motor untuk informasi genetik dalam menghasilkan suatu spesies
• DNA  berasal dari
subunit terkecil disebut
nukleotida yang terdiri
dari molekul gula fosfat
dengan nitrogen yang
mengandung gugus
sebelah, atau basa.

• Basa ada 4 tipe (Adenin,

Guanin, Sitosin dan
Timin)
• Molekul DNA terdiri dari 2
rantai ganda. Nukleotida
dalam setiap untaian yang
dihubungkan oleh ikatan
kimia yang kuat (kovalen)
berupa ikatan hidrogen.

• Terdapat 2 untaian yang

membentuk double helix
 struktur yang mampu
mengakomodasi setiap
sekuens nukleotida tanpa
mengubah struktur dasar
 POLYMERASE
CHAIN REACTION RFLP
(PCR)

ELEKTROFORESIS RT-PCR

TEKNIK-
TEKNIK
ISOLASI DNA SEQUENSING
dan RNA DALAM DNA
BIOLOGI
MOLEKULER
ISOLASI DNA

Isolasi DNA  teknik untuk pengambilan DNA murni dari sampel sel yang
berinti

Isolasi DNA menggunakan metode Guanidine Isothiocyanate

Pada prinsipnya, ekstraksi DNA terbagi atas 5 tahapan:

• (1) Preparasi sel/ jaringan,

• (2) Lisis membran sel/organella (nukleus),
• (3) Denaturasi senyawa organik,
• (4) Presipitasi DNA,
• (5) Pencucian/washing.
Untuk sampel darah segar, gunakan EDTA untuk mengurangi degradasi DNA.

Jumlah DNA yang dapat diisolasi dari sampel darah sangat tergantung pada
jumlah sel leukosit yang terdapat pada sampel dan kondisi penyimpanan
darah. Rata-rata, 350 µg DNA dapat diisolasi dari 10ml sampel darah segar.

Sampel yang telah dibekukan pada suhu -80ᵒC akan menurunkan sekitar 15%
perolehan DNA.

Untuk hasil terbaik, darah harus disimpan pada suhu 4ᵒC tidak lebih dari 5
hari atau dapat disimpan pada -80ᵒC tetapi segera setelah sampel diperoleh.

Buffy coats dapat disimpan pada suhu 4ᵒC atau -80ᵒC sebelum diproses.

Hasil isolasi DNA telah diperoleh  elektroforesis atau PCR untuk

mengidentifikasi panjang amplikon atau ukuran molekul DNA.
ISOLASI RNA

Ekspresi suatu gen dianalisis melalui 4 tahap yaitu:

• Isolasi RNA dari jaringan atau sel,
• reverse transkripsi dari RNA menjadi cDNA menggunakan enzim reverse
transcriptase,
• amplifikasi cDNA dengan PCR dan
• kuantifikasi dan deteksi produk cDNA secara real-time PCR.
Konsentrasi total dan rasio RNA
• diperiksa dari 1 µL resuspensi RNA menggunakan Nanodrop
spektrofotometer pada absorbansi 260:280 menunjukkan kualitas RNA
yang baik (A260:280>1,8)
ALAT UNTUK MENGUKUR KONSENTRASI RNA
HASIL PEMBACAAN KONSENTRASI RNA

Rasio RNA > 1,8 = Kualitas RNA baik (murni)

reaksi reverse transcription (RT) ≠ efisien dan

Rasio RNA < 1,8 = tidak murni menurunkan hasil cDNA.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Reaksi berantai polymerase (PCR) adalah metode amplifikasi suatu sekuens DNA
tertentu. PCR merupakan cara yang sensitif selektif, dan sangat cepat untuk
memperbanyak sekuens DNA yang diinginkan.

Sampel DNA mula-mula dipanaskan untuk memisahkan kedua untai; primer

dibiarkan berikatan dengan DNA; dan masing-masing untai disalin oleh suatu DNA
polimerase yang dimulai di tempat primer.

Kedua untai DNA masing-masing berfungsi sebagai cetakan untuk sintesis DNA baru
dari dua primer.

Siklus berulang denaturasi panas, penyatuan primer dengan sekuens

komplementernya, dan pemanjangan primer yang telah menyatu tersebut dengan
DNA polimerase menyebabkan eksponensial segmen DNA dengan panjang
tertentu.Reaksi-reaksi PCR awal menggunakan suatu DNA polimerase E.coli yang
rusak oleh setiap siklus denaturasi panas.
Denaturasi Annealing Elongasi
Keunggulan metode PCR adalah kemampuannya dalam
melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga dapat
mencapai 109 kali lipat  kontaminasi fragmen DNA dalam
jumlah sangat sedikit sekalipun dapat menyebabkan
terjadinya kesalahan yaitu dengan didapatkannya produk
amplifikasi yang tidak diinginkan atau bahkan tidak spesifik.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam PCR:

• Konsentrasi dan kualitas DNA
• Temperatur Annealing dari kedua primer
• Konsentrasi MgCl2
• Enzim Polimerase
• Konsentrasi dan kualitas primer
• Jumlah Siklus PCR
• Deoksinukleotida triphosphate (dNTP)
ALAT PCR
ELEKTROFORESIS
Elektroforesis
• berasal dari kata Electro-phoresis = “being carried” juga dikenal dengan “Electrically
induced movement of particles” yaitu gerakan partikel yang bermuatan di dalam suatu
media yang diberi arus listrik.
Elektroforesis adalah
• suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik,
dimana kecepatan migrasinya, tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul
yang terlibat

Molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat dari pada yang besar, sehingga akan
terjadi pemisahan.

Semua fragmen tadi akan bergerak dari sisi gel yang bermuatan negative ke arah ujung
yang bermuatan positif. Fragmen yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan
yang berukuran lebih besar

Apabila arus listrik dihentikan, fragmen DNA tadi telah terpisah-pisah di dalam gel
tersebut dan yang berukuran kecil akan lebih dekat pada ujung positif
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

• Urutan nukleotida DNA terdiri dari daerah yang mengkode gen

yang disebut sebagai ekson, daerah bukan pengkode (non-
coding) DNA yang disebut intron, regulator gen dan daerah
urutan berulang seperti mikrosatelit, telomer, variabel number
tandem repeat (VNTR), sequence-tagged sites (STS), dan single
nucleotide polymorphism (SNP).

• Metode dasar yang digunakan untuk mengidentifikasi mutasi,

polimorfisme, dan kajian evolusi baik dengan teknik restriction
fragment length polymorphism (RFLP) maupun amplifikasi DNA
dengan polymerase chain reaction (PCR).

• Kedua teknik ini juga digunakan untuk analisis polimorfisme,

hasil amplifikasi juga dapat digunakan untuk pembuatan DNA
rekombinan, cloning, dan sekuensing.
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

• Yang sangat penting adalah enzim nuclease retriksi,

suatu kelompok enzim-enzim bakteri yang memotong
untaian ganda DNA secara spesifik di untaian tertentu

• Misalnya, EcoRI, suatu nuclease yang diisolasi dari

bakteri Escherichia coli. Seperti endonuklease
lainnya, EcoRI memutus DNA secara palindromic,
artinya suatu potongan pendek untaian ganda DNA
yang kedua untaiannya mempunyai urutan yang
sama, bila masing-masing untaian dibaca dengan
arah 5’ 3’, dalam hal ini adalah urutan 5’-GAATTC-3
REAL TIME PCR (RT-PCR)

• Metode untuk mengetahui ekspresi suatu gen secara real

• Produk PCR dalam real-time dideteksi dengan flouresence

dye seperti SYBR green I atau Evagreen yang
memancarkan cahaya ketika berikatan dengan dsDNA
(Deprez et al., 2002).
• Hasil amplifikasi DNA terdeteksi ketika sinyal flouresence
melewati garis threshold yang biasa ditulis sebagai nilai CT
seperti yang terlihat pada kurva amplifikasi.

• Jumlah DNA yang diamplifikasi sebanding dengan

peningkatan sinyal flouresence yang terbentuk selama
siklus PCR berlangsung (Yuan et al., 2006).
REAL TIME PCR (RT-PCR)

• Menurut Nolan et al. (2006), analisis kurva leleh

dalam real-time digunakan untuk menilai akurasi
produk DNA yang teramplifikasi dan
membedakannya dari primer dimer maupun produk
non spesifik

• Perbedaan suhu leleh ini dapat disebabkan oleh

ukuran produk DNA dan komposisi nukleotidanya,
yaitu amplikon yang GC-rich memiliki suhu leleh
yang lebih tinggi dibandingkan dengan amplikon
yang mengandung banyak pasangan basa AT
REAL TIME PCR (RT-PCR)
Kurva amplifikasi DNA. Garis hijau adalah threshold, garis biru adalah produk
DNA gen target (sampel), garis ungu menunjukkan produk DNA gen kontrol
(GAPDH) dan garis merah adalah no template control (NTC).
 Kurva leleh DNA. Garis biru adalah produk DNA gen target (RAGE), garis
ungu menunjukkan produk DNA gen kontrol (GAPDH) dan garis merah adalah
no template control (NTC).
Kurva leleh peak DNA. Produk DNA gen target (RAGE) terdeteksi pada suhu
78°C (biru), produk DNA gen kontrol (GAPDH) pada suhu 87°C (ungu) dan
garis merah adalah no template control (NTC).
• Produk DNA yang teramplifikasi ditampilkan
dengan nilai CT (cycle of threshold)

• Tingkat ekspresi gen RAGE dihitung

menggunakan rumus 2-ΔΔCT (perhitungan Livak)
DNA SEQUENSING

• Sequensing DNA merupakan teknik terbaik yang

digunakan dalam biologi molekuler

• Penentuan untaian DNA merupakan satu-

satunya metode dalam ilmu biologi yang
menghasilkan data yang tidak bias oleh praduga,
hipotesis atau desain penelitian

• Metode ini ditemukan pertama kali oleh

Maxam-Gilbert yang menggunakan basa spesifik
untuk memotong fragmen DNA
DAFTAR PUSTAKA

The main reference is Molecular Biology of the Cell, 5th edition, 2008 by Alberts
et al. published by Garland Science

Deprez-Lekanne, R.H., Fijnvandraat, A.C., Ruijter, J.M., Moorman, A.F.M., 2002.

Sensitivity and accuracy of quantitative real-time polymerase chain reaction using
SYBR green I depend on cDNA synthesis conditions. Anal Biochem. 307:63-9.

Fatchiyah, Arumingtyas Laras E, Widyarti S, Rahayu S. Biologi Molekuler :

Prinsip Dasar Analisis. Jakarta. Erlangga. 2011. hal : 48-57

Koolman, J. Colour Atlas of Bichemistry. 2nd Edition. New York. Thieme. 2005.
hal. 236-37

Nolan, T., Hands, R.E., and Bustin, S.A., 2006. Quantification of mRNA using
real-time RT-PCR. Nat Protoc. 3(1):1559-82.

Yuan, J.S., Reed, A., Chen, F., Stewart-Jr, C.N. 2006. Statistical analysis of real-
time PCR data. BMC Bioinformatics. 7:85 doi:10.1186/1471-2105-7-85.
DAFTAR PUSTAKA