Metode Analisis DNA RNA

Rinjani Ayundatika Putri

24030123420010
 DNA and RNA
DNA (asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam
ribonukleat) adalah dua jenis asam nukleat yang
memainkan peran penting dalam penyimpanan,
transmisi, dan ekspresi informasi genetik dalam
organisme hidup.
DNA and RNA
Sequencing
Sequencing
Sequencing mengacu pada penentuan
urutan nukleotida dalam DNA atau RNA.
Metode berperan penting dalam berbagai
bidang seperti ilmu biomedis, studi
genomik, genotipik mikroorganisme, dan
identifikasi penyakit genetik.
Sanger Sequencing
Sanger’s Method

Sanger sequencing metode yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida

DNA. Metode ini dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1977

Prinsip : Metode pemutusan rantai, yang didasarkan pada penggabungan selektif

dideoksinukleotida pemutus rantai (ddNTP) selama sintesis DNA.

Procedure
1) Denaturasi DNA : Templat DNA untai ganda dipanaskan hingga sekitar 95°C
untuk memisahkannya menjadi dua untai tunggal.
2) Making Multiple Copies of DNA : Salinan DNA disintesis dari templat tunggal.
3) Attach a primer : Primer ini melengkapi ujung 3' dari templat dan memberikan
titik awal bagi DNA polimerase untuk memulai sintesis.
4) Adding Four Polymerization Solutions : Setiap larutan mengandung template
DNA polymerase yang ditambahkan dengan dATP, dCTP, dTTP, dan dGTP.
5) Growing Complementary Chains : Polimerase DNA mulai mensintesis untaian
DNA baru dengan menambahkan dNTP yang saling melengkapi.
6) Denaturing the Grown Chains
7) Electrophoresis : Fragmen DNA dari keempat reaksi tersebut kemudian
menjalani elektroforesis kapiler. Pewarna fluoresen yang melekat pada
terminal ddNTP akan memancarkan cahaya.
New Generation Sequencing (NGS)
Next-generation sequencing (NGS)
teknologi revolusioner yang memungkinkan
pengurutan DNA dan RNA yang cepat dan
hemat biaya. teknologi revolusioner yang
memungkinkan pengurutan DNA dan RNA
yang cepat dan hemat biaya

Prinsip : NGS memecah DNA atau RNA

menjadi jutaan fragmen kecil yang kemudian
disekuensing secara bersamaan dalam satu
siklus. Hasil dari setiap fragmen kemudian
direkonstruksi dengan perangkat lunak khusus
untuk menghasilkan urutan genomik atau
transkriptase keseluruhan.
 ILLUMINA NEXT GENERATION SEQUENCING

Procedure
1) Library Preparation : Fragmentasi DNA End Repair and A-Tailing Library Amplification
2) Cluster Generation : Bridge Amplification DNA Denaturation (Kelompok DNA untai ganda didenaturasi untuk
membuat templat untai tunggal)
3) Sequencing-by-Synthesis (SBS) : Pengurutan Illumina didasarkan pada SBS, di mana nukleotida yang diberi label
fluoresen ditambahkan satu per satu ke untai DNA yang sedang tumbuh.
4) Adding Four Polymerization Solutions : Setiap larutan mengandung template DNA polymerase yang ditambahkan dengan
dATP, dCTP, dTTP, dan dGTP.
5) Data Analysis : Sinyal fluoresen dari gambar diubah menjadi panggilan basa (A, C, G, T) menggunakan perangkat lunak
Illuminaapos.
6) Visualisasi : Hasil sering divisualisasikan menggunakan alat bioinformatika untuk memfasilitasi interpretasi data.
DNA and RNA
Purification
DNA Purification
Pemurnian Elektroforesis Gel : Teknik pemisahan
makromolekul seperti DNA, RNA, dan protein berdasarkan
ukuran dan muatannya.

Prinsip : Fragmen DNA dipisahkan berdasarkan ukurannya

menggunakan elektroforesis gel agarosa. Sampel DNA
dimasukkan ke dalam sumur di dalam gel, dan arus listrik
dialirkan, menyebabkan fragmen-fragmen DNA bermigrasi
melalui gel berdasarkan ukuran dan muatannya.

Procedure
1. Pemuatan Sampel DNA : DNA dimasukkan ke dalam sumur di
salah satu ujung gel agarosa.
2. Penyaluran Medan Listrik : Molekul DNA yang bermuatan negatif
akan bergerak menuju elektroda positif (anoda) ketika diberi
tegangan.
3. Pemisahan DNA
4. UV Transillumination & Documentation
5. Fragmen DNA yang telah dimurnikan dapat digunakan untuk
berbagai aplikasi hilir, termasuk kloning, pengurutan, amplifikasi
PCR, dan analisis struktur 3D
RNA Purification
Silica-based column purification : Metode
yang digunakan untuk mengisolasi dan
memurnikan RNA dari sampel biologis.

Prinsip : Pengikatan selektif partikel silika

dengan adanya garam chaotropik untuk
menangkap molekul RNA sekaligus
menghilangkan kontaminan seperti protein,
DNA, dan pengotor lainnya.

Procedure
 Lisis Sel dan Stabilisasi RNA
 Pengikatan RNA ke Kolom Silika
 Pencucian dan Penghapusan Kontaminan
 Elusi RNA yang Dimurnikan
 Kuantifikasi RNA dan Penilaian Kualitas
 RNA yang telah dimurnikan sekarang siap
untuk aplikasi hilir seperti reaksi rantai
polimerase transkripsi balik (RT-PCR),
analisis ekspresi gen, analisis struktur
RNA.
REAL – TIME PCR
Real-time PCR, juga dikenal sebagai PCR kuantitatif (qPCR),
adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk mengamplifikasi
dan secara bersamaan mengkuantifikasi molekul DNA yang
ditargetkan. Produk dideteksi saat sedang disintesis secara real-
time, bukan pada akhir proses PCR.

Prinsip : PCR kuantitatif (qPCR), berkisar pada deteksi dan

kuantifikasi target DNA tertentu secara waktu nyata saat proses
amplifikasi terjadi.

Tahapan Umum
 DNA target : Sampel DNA yang mengandung sekuens target
ditambahkan dengan primer dan reagen PCR.
 Desain Primer : Primer spesifik dirancang untuk mengikat daerah
yang mengapit sekuens DNA target.
 Pelapor Fluoresen
 Pewarna SYBR Green, mengikat DNA untai ganda dan
memancarkan fluoresensi ketika terikat.
 Sistem Berbasis Probe
 Amplifikasi PCR : Reaksi PCR dilakukan dalam thermal cycler,
yang berputar melalui tiga langkah suhu utama, yaitu denaturasi,
annealing, ekstensi.
 Deteksi Fluoresensi : Selama setiap siklus amplifikasi,
fluoresensi yang dipancarkan oleh pewarna reporter diukur.
 Analisis Data dan Kuantifikasi
Droplet Digital PCR
Droplet Digital PCR : Generasi baru teknik PCR, yang
memungkinkan kuantifikasi asam nukleat (DNA/RNA) dengan
presisi dan sensitivitas tinggi.

Prinsip : Partisi sampel menjadi ribuan tetesan berukuran

nanoliter, masing-masing mengandung molekul DNA tunggal atau
urutan target.

Tahapan Umum
 Droplet Generation (microfluid technology) : Droplets dibentuk
dengan mendispersikan fase air yang mengandung campuran
reaksi PCR ke dalam fase minyak kontinu, untuk mencegah
tetesan bergabung satu sama lain.
 Enkapsulasi Stokastik : Asam nukleat didistribusikan secara
acak ke dalam tetesan ini, dengan tujuan agar setiap tetesan
mengandung satu atau nol salinan DNA/RNA target.
 Amplifikasi PCR
 Kuantifikasi : Konsentrasi asam nukleat target dalam sampel asli
berdasarkan proporsi tetesan fluoresen (berpendar) dan non-
fluoresen, menggunakan distribusi Poisson.
 Platform komersial : BioMark HD (Fluidigm), OpenArray dan
QuantStudio 12K Flex (Life Technologies), RainDrop (RainDance
Technologies), Bio-Rad QX200 Droplet Digital, dan NAICA (Stilla
Technologies),
Prosedur Droplet Digital PCR
Procedure
1) Sample Preparation : Sampel yang mengandung
sekuens DNA target disiapkan bersama dengan
reagen yang diperlukan untuk PCR.
2) Droplet Generation : Campuran reaksi PCR yang
telah disiapkan kemudian diemulsikan dalam
minyak untuk menghasilkan ribuan tetesan
berukuran nanoliter.
3) Amplifikasi PCR
4) Read Results : Setiap tetesan diklasifikasikan
sebagai positif (mengandung DNA target atau
berpendar) atau negatif (tidak berpendar).
Amplitudo sinyal fluoresen menunjukkan apakah
tetesan mengandung sekuens target.
5) Visualization of Data : Plot sebar, setiap titik
mewakili tetesan. Sumbu y (amplitudo
fluoresensi), menunjukkan keberadaan DNA
target. Sumbu x menunjukkan jumlah tetesan.
Garis ambang batas ditetapkan untuk
membedakan antara tetesan positif dan negatif.
 DNA and RNA
Structure Analysis
Analisis Struktur DNA & RNA
X-ray Cyrstallography : Teknik yang digunakan untuk
menentukan struktur tiga dimensi bahan kristal,
termasuk makromolekul biologis seperti protein dan
asam nukleat.

Prinsip : Paparan sinar-X ketika mengenai kristal

biomolekul seperti DNA atau RNA akan dihasilkan pola
difraksi.

Procedure
1) Kloning, ekspresi, dan pemurnian DNA atau RNA
2) Kristalisasi DNA atau RNA
3) Kristal diperoleh
4) Penentuan Peta Kerapatan Elektron
5) Penghalusan kristalografi
6) Model kristal yang telah disempurnakan
7) Analisis Bioinformatika dan Model
Genomic Library
 Pustaka Genom
Perpustakaan genom adalah kumpulan fragmen DNA
yang mewakili seluruh genom suatu organisme.
Pustaka genom berperan untuk menyimpan,
mereplikasi, dan mempelajari materi genetik suatu
organisme.

1. Perpustakaan Genomik : Representasi seluruh

genom suatu organisme. Perpustakaan ini dibuat
dengan memecah-mecah DNA genom menjadi
potongan-potongan yang lebih kecil dan lebih
mudah diatur dan mengkloning fragmen-fragmen
ini ke dalam vektor, seperti plasmid atau
bakteriofag.

2. Perpustakaan cDNA : Kumpulan fragmen DNA

yang komplementer dengan molekul messenger
RNA (mRNA) yang ada di dalam sel pada waktu
tertentu atau di bawah kondisi tertentu.
Perpustakaan cDNA dihasilkan dengan
mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA
menggunakan enzim reverse transcriptase.
Procedure Perpustakaan Genomik
1) Pemotongan DNA menjadi fragmen-
fragmen yang lebih kecil menggunakan
enzim nuklease restriksi.
2) Fragmen DNA dimasukkan ke dalam
plasmid. Plasmid dipotong dengan enzim
restriksi untuk memastikan bahwa ujung
fragmen DNA kompatibel dengan ujung
plasmid yang telah dibuka.
3) Plasmid rekombinan kemudian
dimasukkan ke dalam sel bakteri melalui
proses transformasi.
4) Penyusunan perpustakaan DNA genomik.

Perpustakaan genom digunakan untuk

berbagai tujuan, termasuk pemetaan gen,
pengurutan, dan studi fungsional.
Procedure Perpustakaan cDNA
1) Isolasi molekul messenger RNA (mRNA) dari
sel.
2) Transkripsi balik mRNA menjadi cDNA
menggunakan enzim reverse transcriptase.
3) Pencernaan cDNA dengan Enzim Pembatas
4) Vektor adalah molekul DNA yang digunakan
untuk membawa materi genetik asing ke
dalam sel lain untuk direplikasikan.
5) Penggabungan (ligase) cDNA ke DNA vector
6) Penyisipan DNA ke dalam E. coli
7) Amplifikasi Perpustakaan
8) Isolasi DNA dari E. coli
9) Koleksi Perpustakaan cDNA.

Perpustakaan ini dapat digunakan untuk berbagai

aplikasi, seperti analisis ekspresi gen, kloning gen,
dan produksi protein rekombinan.
THANK YOU