Tipe metode bioassay

Jenis metode bioassay

 Metode In Vivo
Pengujian dilakukan pada organisme hidup seperti hewan atau
manusia untuk mengevaluasi efek biologis suatu substansi.
 Metode In Vitro (dilakukan di luar organisme hidup)
 Sel Kultur: Penggunaan sel atau jaringan yang tumbuh di dalam kondisi
laboratorium untuk mengukur respons terhadap suatu substansi.
 Enzimatis: Mengukur aktivitas enzim sebagai indikator respons terhadap
suatu zat.
 Receptor Binding Assay: Mengukur interaksi suatu substansi dengan
spesifik pada sel atau jaringan.
 Virus atau Bakteri: Penggunaan mikroorganisme untuk mengukur efek
suatu substansi terhadap perkembangan atau reproduksi.
 Bioassay Fisik:
 Radiobioassay: Menggunakan radiasi atau isotop untuk mengukur efek
biologis.
 Bioassay Thermik: Mengukur dampak suhu terhadap organisme hidup.

 Metode Statistik dan Matematika:

Analisis Dosis-Respon: Menggunakan analisis matematis untuk menentukan hubungan
antara dosis suatu substansi dan respons biologis.

 Bioassay Bioinformatika:
Metode Bioinformatika: Menggunakan teknik-teknik bioinformatika untuk menganalisis
data biologis yang dihasilkan dari eksperimen bioassay.
Metode in-vitro (dilakukan di luar organisme hidup)

• Bioassay in vitro adalah metode pengujian aktivitas biologis atau efek

biologis suatu zat yang dilakukan di dalam lingkungan laboratorium,
di luar tubuh organisme hidup.
• Metode ini sering digunakan untuk mengurangi ketergantungan pada
hewan dan memberikan hasil yang lebih cepat dan efisien.
• Hasil bioassay in vitro dapat memberikan informasi awal tentang
aktivitas biologis suatu zat, namun untuk memahami secara
menyeluruh interaksi dalam sistem kompleks organisme. uji in vivo
mungkin diperlukan sebagai langkah berikutnya dalam penelitian.
Sel kultur
• Sel kultur adalah teknik yang melibatkan pertumbuhan dan
perbanyakan sel atau jaringan dalam kondisi laboratorium yang
dikendalikan. Metode ini digunakan untuk mengukur respons sel
terhadap suatu substansi atau untuk memahami berbagai aspek
biologis dan farmakologis dari suatu zat
• Sel kultur digunakan untuk uji obat-obatan baru, skrining senyawa
aktif, dan pemahaman lebih lanjut tentang mekanisme kerja suatu zat.
• Sel kultur dapat digunakan untuk mempelajari kemampuan sel untuk
bergerak (migrasi) dan menembus membran atau jaringan (invasi),
yang relevan dalam studi kanker.
1. Tujuan Sel Kultur:
a. Studi tentang pertumbuhan sel, diferensiasi, dan fungsi sel
b. Uji toksisitas atau efek farmakologis suatu substansi pada tingkat
seluler.
c. Pengembangan obat baru.
2. Media Sel Kultur:
a. Nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan sel seperti gula, asam
amino, vitamin, dan faktor pertumbuhan.
b. Faktor-faktor ini disesuaikan untuk mendukung pertumbuhan dan
fungsi sel dengan optimal.
3. Perawatan dan Pemeliharaan Sel:
a. Suhu, kelembaban, dan konsentrasi CO2 dikendalikan untuk
menciptakan kondisi pertumbuhan yang sesuai.
b. Sel kultur secara teratur diberi makan dan dipindahkan ke wadah
yang lebih besar ketika mencapai kerapatan tertentu.
Uji Sitotoksisitas:

• Toksisitas didefinisikan sebagai kemampuan suatu zat yang memiliki

sifat destruktif pada sel terutama yang menyangkut proses suatu sel
dalam sistem kekebalan tubuh (Clayman, 1989).
• Uji toksisitas digunakan untuk mengetahui pengaruh racun yang
dihasilkan oleh dosis tunggal dari suatu campuran zat kimia pada
hewan coba sebagai uji pra skrining senyawa bioaktif antikanker (
Hamburger & Hostettmann, 1991; Mc. Laughlin & Rogers, 1998)
• Menggunakan pewarna seperti MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyltetrazolium bromide) untuk mengukur aktivitas sel hidup.
Nilai sitotoksisitas
• nilai-nilai IC50, (<100 μg/ml): kuat
• sedang (101-200 μg/ml)
• lemah (>200 μg/ml).
• Semakin rendah nilai IC50 semakin tinggi toksisitas terhadap kematian
sel kultur
Prinsip dasar metode MTT assay
• Perubahan warna perekasi MTT dari kuning menjadi biru yang
disebabkan oleh adanya sel kanker yang hidup dan sel tersebut mati
maka perubahan warna
• Aktivitas dinyatakan dalam IC50 yaitu konsentrasi sampel yang
dibutuhkan untuk menginhibisi 50% sel kanker melalui pewarnaan
pereaksi MTT
Tujuan:
• Merupakan langkah awal pada pencarian senyawa senyawa yang
bersifat antikanker
• Dalam rangka menuju kearah antikanker maka dikembangkan sejumlah
sel kanker sesuai dengan jenis kankernya
• Jenis kanker
• Kanker karsinoma mulut (KB)
• Kanker payudara (BC, MDA-MDB)
• Kanker tenggorokan (NCI-H187)
• Kanker rahim (A2780, SK-OV, SKVLB)
• Sel tumor otak ( SF-295, SF-593, SNB-75)
• Sel tumor leukimia ( CEM, HL-60, MOLT-4)
Alur pengujian dengan MTT

Sterilisasi

Pemanenan Penghitungan
sel sel

Pengukuran Penanaman
absorbansi Treatment sel
PENGUKURAN
• MOTALITY
• VIABILITY CELL
• PROLIFERATION
• APOPTOSIS
Calculation formula:

•
•

% mortalitas

konversi ke angka probit

Nilai IC 50
• Ukur pada panjang gelombang 540 nm
• Nilai IC50 dihitung melalui eksplorasi garis 50% serapan kontrol pada
kurva serapan terhadap berbagai konsentrasi sampel menggunakan
grafik semilogaritma.
Uji Proliferasi Sel:

• Menilai kemampuan suatu zat untuk merangsang atau menghambat

pertumbuhan sel. Proliferasi sel dapat diukur menggunakan metode seperti
penghitungan jumlah sel atau penggunaan indikator proliferasi sel.
• Uji proliferasi sel adalah metode untuk menilai kemampuan suatu zat atau
kondisi tertentu untuk merangsang atau menghambat pertumbuhan sel.
• Proliferasi sel adalah proses pembelahan sel yang menghasilkan peningkatan
jumlah sel.
• Menggunakan pewarna seperti MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide)
• Namun, perlu diingat bahwa hasilnya hanya memberikan gambaran umum
tentang viabilitas dan aktivitas metabolik sel
Langkah-langkah uji proliferasi sel
1. Penyiapan Sel Kultur:
Mulailah dengan pertumbuhan dan persiapan sel kultur di wadah yang sesuai, sesuai dengan kebutuhan eksperimen Anda.
2. Perawatan Sel dengan Zat Uji:
Setelah mencapai kerapatan sel yang diinginkan, tambahkan zat uji atau kondisi perlakuan ke sel kultur. Pastikan bahwa kontrol tanpa perlakuan juga disiapkan.
3. Inkubasi:
Biarkan sel mengalami perlakuan pada suhu dan kondisi inkubasi yang sesuai selama periode yang telah ditentukan.
4. Penambahan MTT:
Tambahkan larutan MTT ke dalam setiap sumuran atau wadah kultur sel. MTT akan diubah menjadi kristal formazan oleh aktivitas metabolik sel hidup.
5. Inkubasi Tambahan:
Biarkan MTT diinkubasi dengan sel selama beberapa jam agar terjadi reaksi kimiawi yang dapat menghasilkan produk warna yang dapat diukur.
6. Pemecahan Kristal Formazan:
Setelah inkubasi, hapus larutan MTT dari sumuran atau wadah dan tambahkan agen pelarut seperti DMSO (dimethyl sulfoxide) untuk larutkan kristal formazan.
7. Pengukuran Absorbansi atau Fluoresensi:
1. Ukur absorbansi atau fluoresensi larutan untuk mendapatkan nilai yang merefleksikan jumlah sel hidup dan aktivitas metaboliknya.
2. Pada umumnya, menggunakan spektrofotometer untuk mengukur absorbansi pada panjang gelombang tertentu.
8. Analisis Data:
Bandingkan hasil pengukuran antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Pengurangan aktivitas metabolik atau penurunan absorbansi dapat menunjukkan
penghambatan proliferasi sel.
 Deteksi BrdU (Bromodeoxyuridine):
BrdU adalah analog timidin yang dapat diinkorporasikan ke dalam DNA sel selama fase sintesis. Deteksi BrdU membantu dalam mengidentifikasi sel yang
mengalami pembelahan dan memberikan informasi tentang laju proliferasi.
Berikut langkah-langkah:
1. Perlakuan Sel dengan BrdU:
Tambahkan BrdU ke dalam medium kultur untuk mengizinkan sel mengambil dan menginkorporasikannya ke dalam DNA selama fase sintesis.
2. Fiksasi Sel:
Setelah periode inkubasi dengan BrdU, fiksasi sel dengan menggunakan agen fiksasi seperti paraformaldehid.
3. Pembukaan DNA:
Gunakan agen seperti asam perklorat atau enzim DNAse untuk membuka struktur DNA dan memungkinkan akses antibodi terhadap BrdU.
4. Deteksi BrdU dengan Antibodi:
1. Gunakan antibodi anti-BrdU yang dikonjugasi dengan fluorokrom atau enzim untuk mendeteksi lokasi BrdU di dalam DNA sel.
2. Fluorokrom memberikan sinyal fluoresensi yang dapat diukur dengan mikroskop atau alat aliran sitometri. Enzim dapat diukur dengan
menggunakan substrat enzimatik dan mengukur absorbansi.
5. Analisis Data:
Analisis data melibatkan perhitungan persentase sel yang mengandung BrdU dan dapat memberikan informasi tentang laju proliferasi.

Metode MTT dan BrdU memberikan wawasan tentang aktivitas seluler dan dapat digunakan untuk memahami pengaruh suatu zat atau kondisi terhadap
proliferasi atau viabilitas sel.
Uji Apoptosis:

• Uji apoptosis menggunakan pewarna khusus adalah metode yang

umum digunakan untuk mendeteksi dan mengukur apoptosis
(kematian sel terprogram) dalam populasi sel.
• Salah satu pewarna yang sering digunakan adalah Annexin V.
• dapat diukur dengan mengamati perubahan morfologi sel, ekspresi
protein terkait apoptosis.
• Pewarna dengan Annexin V merupakan alat yang kuat dalam
memahami dan memonitor proses apoptosis pada tingkat seluler.
Langkah Langkah uji apoptosis
1. Penyiapan Sel Kultur:
Mulailah dengan pertumbuhan dan persiapan sel kultur di wadah yang sesuai, sesuai dengan kebutuhan eksperimen Anda.
2. Perlakuan Sel dengan Zat Uji:
Setelah mencapai kerapatan sel yang diinginkan, tambahkan zat uji atau kondisi perlakuan ke sel kultur. Pastikan bahwa kontrol tanpa perlakuan
juga disiapkan.
3. Inkubasi:
Biarkan sel mengalami perlakuan pada suhu dan kondisi inkubasi yang sesuai selama periode yang telah ditentukan.
4. Pengumpulan Sel:
Hapus medium kultur dan kumpulkan sel dengan menggunakan metode yang sesuai seperti trypsinisasi atau perendaman dalam PBS
(Phosphate-Buffered Saline).
5. Pencucian Sel:
Cuci sel dengan PBS untuk menghilangkan sisa medium kultur dan menghentikan reaksi.
6. Pewarnaan dengan Annexin V:
Resuspend sel dalam larutan binding buffer yang mengandung pewarna Annexin V, biasanya berlabel dengan fluorokrom seperti FITC
(Fluorescein Isothiocyanate).
Inkubasikan sel dengan pewarna selama beberapa waktu tertentu di dalam gelap.
7. Pewarnaan dengan Pewarna Nukleus:
Bisa juga melakukan pewarnaan dengan pewarna nukleus, seperti propidium iodide (PI) atau DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), untuk
membedakan sel hidup dan sel mati.
8. Analisis dengan Aliran Sitometri:
1. Gunakan alat aliran sitometri untuk mengukur fluoresensi Annexin V dan pewarna nukleus pada setiap sel.
2. Pembacaan fluoresensi Annexin V dan pewarna nukleus dapat membantu mengklasifikasikan sel-sel sebagai hidup, apoptotik, atau nekrotik.
9. Analisis Data:
Analisis data aliran sitometri dapat memberikan persentase sel yang mengalami apoptosis dan memberikan informasi tentang stadium proses
apoptosis.
Viabilitas sel
• Viabilitas sel adalah kemampuan suatu sel untuk tetap hidup atau
bertahan dalam kondisi tertentu
• Evaluasi viabilitas sel penting dalam berbagai eksperimen biologis dan
farmakologis untuk memahami pengaruh suatu zat atau kondisi
terhadap kelangsungan hidup sel.
Metode untuk mengevaluasi viabilitas sel
1. Pengecatan Pewarna Hayati (Staining):
1. Menggunakan pewarna hayati seperti trypan blue atau propidium iodide untuk membedakan sel hidup
dan sel mati.
2. Sel hidup biasanya tidak menyerap atau menahan pewarna, sedangkan sel mati atau tidak viabel akan
menyerap pewarna dan terlihat berwarna di bawah mikroskop.
2. Pewarnaan dengan Trypan Blue:
1. Trypan blue adalah pewarna hayati yang dapat menembus membran sel sel mati.
2. Pewarnaan sel dengan trypan blue memungkinkan penghitungan sel hidup dan sel mati di bawah
mikroskop.
3. Pemantauan Morfologi Sel:
Pengamatan langsung di bawah mikroskop untuk melihat perubahan morfologi sel, seperti pembengkakan
atau pelebaran, yang dapat mengindikasikan ketidaknormalan atau kematian sel.
4. Pengukuran Laju Pertumbuhan Sel:
Melibatkan pengukuran laju pertumbuhan sel pada interval waktu tertentu untuk menilai viabilitas sel dalam
suatu populasi.