A.

Chinese Herbal Medicines

Chromatographic (TLC and HPLC) Fingerprint Analysis

of Herbal Medicines
Introduction Pembuktian kualitas obat – obatan cina harus berbasis pada sains dan
memenuhi standar tinggi dari Otoritas Pengawas Obat Eropa. Kami
memutuskan untuk menggunakan teknik analisis sidik jari KLT
kromatografi dan HPLC. Metode ini memungkinkan peneliti untuk
mendeteksi kandungan kompleks dari semua konstituen molekul
rendah utama pada obat herbal, dengan keuntungan bahwa konstituen
tunggal dapat diamati dalam foto-foto KLT berwarna dan dalam profil
puncak HPLC yang dapat diukur. Teknik ini juga dapat digunakan
untuk menyingkirkan kemungkinan pemalsuan dan pemalsuan obat
herbal.

Processing of TCM-drugs (Traditional Chinese Medicine)

Farmakope Cina menjelaskan banyak jenis pre-treatment atau
pemrosesan lain yang. Farmakope Cina 2010 (Republik Rakyat Cina,
Edisi Bahasa Inggris Vol I Lampiran II A - 25-27), pengolahan
didefinisikan untuk memenuhi persyaratan obat. Tujuan pengolahan
dijelaskan sebagai "untuk mengubah penampilan, karakteristik fisik
dan konstituen kimiawi obat herbal" (lihat Zhao et al. 2010). Namun,
tidak ada satu pun monograf yang menjelaskan bahwa obat-obatan
mentah mengandung konstituen beracun, perlunya berbagai
pemrosesan dirasionalisasi dan dibuktikan dengan jelas. Pengolahan
dapat dilakukan dengan beberapa metode yaitu, memanggang,
mendidih/merebus, mengapur, mengkarbonisasi, mengukus, mengolah
dengan anggur, cuka, atau air garam. Beberapa bahan kimia atau obat
herbal juga dapat digunakan untuk pemrosesan.

Pengobatan Tradisional Cina (TCM), khususnya Aconitum spp.

(Aconitum carmichaeli dan Aconitum kusnezoffii) mengalami proses
pre-treatment terlebih dahulu. Penelitian ini menjelaskan metode
pengolahan yang digunakan pada tanaman obat ini sesuai dengan
Farmakope Cina, seperti menggunakan air asin, Radix Glycyrrhizae,
kacang hitam, atau pemanasan suhu tinggi dengan pasir. Analisis
menunjukkan bahwa pemrosesan menyebabkan degradasi alkaloid
seperti Aconitine dan Mesaconitine pada Aconitum spp., membuat
mereka hadir dalam jumlah yang lebih kecil dibandingkan dengan akar
mentah yang belum diproses.
 Alkaloid Aconitine dan Mesaconitine yang ditemukan dalam Aconitum
spp. diketahui sangat beracun dan dapat menyebabkan masalah
kesehatan yang serius jika dikonsumsi dalam jumlah besar.

Senyawa target yang akan saya gunakan turunan asam sinamat yaitu, p-
coumaric acid dan ferulic acid.

Oldenlandiae (Bai hua she she cao)

Herba Official drug : [ 3 ] Herba Oldenlandiae adalah ramuan utuh kering
Oldenlandiae dari (Famili Rubiaceae).
(Bai hua she she Synonym : [ 1 , 5 ] Herba Hedyotidis, Hedyotidis diffusa
cao)

Perlakuan awal obat mentah : [2] Herba dipanen pada musim panas
dan musim gugur, dikeringkan di bawah sinar matahari dan digunakan
selagi segar.
Penggunaan obat : [12] Telah digunakan sebagai obat anti kanker dan
untuk pengobatan penyakit hati (hepatitis) dan radang usus buntu.

Constituents of 1. Iridoids, iridoid glycosides and esters

Oldenlandia 2. Triterpenoids : Oleanolic acid, ursolic acid
diffusa 3. Flavonoid glycosides : Rutin, Quercetin, Kaempferol
4. Phenolic Acids : p-coumaric acid dan ferulic acid
TLC-Fingerprint a. Sampel preparation :
Analysis 1. Timbang 1 gram bubuk obat dan tempatkan dalam wadah
ekstraksi yang sesuai.
2. Tambahkan 25 ml metanol ke dalam bejana ekstraksi yang
berisi obat bubuk.
3. Panaskan campuran di bawah refluks (pendidihan terus
menerus) selama 1 jam untuk memfasilitasi proses ekstraksi.
4. Setelah 1 jam, angkat bejana ekstraksi dari api dan biarkan
dingin hingga mencapai suhu kamar.
5. Saring ekstrak untuk memisahkan cairan (yang mengandung
senyawa yang diekstraksi) dari partikel padat atau kotoran.
6. Menguapkan filtrat (ekstrak cair) hingga kering menggunakan
 metode yang sesuai seperti penguapan putar (rotary evaporator).
7. Setelah filtrat benar-benar kering, larutkan residu dalam 1 ml
metanol untuk melarutkan kembali senyawa yang diekstraksi.
8. Saring larutan yang telah dilarutkan melalui unit filtrasi
Chromafil dengan ukuran pori-pori 0-20 μm dan diameter 25
mm.
9. Kumpulkan larutan yang telah disaring, yang sekarang
mengandung senyawa yang diekstraksi murni, untuk analisis
atau pemrosesan lebih lanjut.
b. Standar preparation :
1. 1 mg dilarutkan dalam 1 mL metanol
c. Metode pemisahan
1. HPTLC Silica gel 60 F 254 , Merck
2. Herba Oldenlandiae extract: 12 μl each
3. Reference compounds (kontrol positif) : 10 μl each
Solvent system 1. Solvent systems :
and detection for Ethyl acetate + methanol + water + glacial acetic acid (15.4 + 3 +
triterpenoids and 2.5 + 0.1) (upper layer)
iridoid 2. Deteksi senyawa :
glycosides Anisaldehida - Reagen asam sulfat
- 0,5 ml anisaldehid dicampur dengan 10 ml asam asetat glasial,
diikuti dengan 85 ml metanol dan 5 ml asam sulfat pekat,
dengan urutan tersebut.
- Pelat disemprot dengan 10 ml reagen, dipanaskan pada suhu
110°C selama 5 menit dan dievaluasi di bawah VIS dan UV 366
nm.

Catatan: Reagen hanya memiliki stabilitas terbatas dan tidak dapat

digunakan lagi ketika warna telah berubah menjadi merah-ungu.
Solvent system 1. Solvent system: Ethyl acetate + formic acid + glacial acetic acid +
and detection for water (10 + 1.1 + 1.1 + 2.6)
flavonoids and 2. Deteksi senyawa :
organic acids Reagen polietilen glikol (NP/PEG)
- 1% asam difenilbenzoat-β-etilamino ester
(difenilboryloxyethylamine, NP) larutkan dalam metanol
- 5% polietilen glikol-4000 (PEG) larutkan dalam etanol
 - Pelat disemprot terlebih dahulu dengan larutan I dan kemudian
dengan larutan II. Evaluasinya adalah dilakukan di bawah UV
366 nm.
HPLC-
Fingerprint
Analysis

Hasil HPLC

B. Oldenlandiae diffuse Induced Apoptosis (Ursolic Acid and Oleanolic Acid)

Oldenlandia diffusa Extracts Exert Antiproliferative and Apoptotic Effects on Human

Breast Cancer Cells Through ERa/Sp1-Mediated p53 Activation
Discussion Dalam penelitian ini, kami telah menunjukkan bahwa ekstrak
Oldenlandia diffusa (OD) memberikan efek antiproliferasi yang
signifikan dan respons apoptosis dengan menginduksi ekspresi gen p53
pada sel kanker payudara MCF-7 positif ER (Estrogen).

Pengobatan OD menghambat pertumbuhan sel kanker payudara ERa-

positif bergantung pada parameter dosis pengobatan OD, sedangkan
OD tidak mempengaruhi pertumbuhan sel kanker payudara SKBR3
negatif ERa serta sel epitel payudara MCF-10A normal. Namun,
mekanisme molekuler yang mendasari aktivitas antikanker dari ramuan
ini perlu dijelaskan dengan lebih baik.

Apoptosis terjadi sebagai hasil dari inisiasi mekanisme kaskade

proteolitik yang mengarah pada fragmentasi DNA yang tidak dapat
dipulihkan. Ekstrak OD secara signifikan meningkatkan apoptosis sel
yang dibuktikan dengan fragmentasi DNA pada sel kanker payudara.
Peningkatan kadar proteolitik PARP pada sel kanker payudara MCF-7
yang diobati dengan OD. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
induksi apoptosis mungkin merupakan mekanisme utama yang
bertanggung jawab atas aktivitas antiproliferasi yang diberikan oleh
ekstrak OD.

Penelitian ini menemukan bahwa ekstrak OD menyebabkan respons

antiproliferatif dan apoptosis yang kuat pada sel kanker payudara
MCF-7 ERa-positif melalui peningkatan ekspresi gen p53. Peningkatan
regulasi gen p53 yang bergantung pada jalur p21WAF1 / Cip1 dapat
menyebabkan apoptosis, mencegah proliferasi sel.

Investigasi fitokimia terhadap OD mengungkapkan bahwa Herba

oldenlandiae memiliki kandungan glukosida iridoid, triterpenoid,
flavonoid, phenolic acids, dan polisakarida [26]. Ekstrak kloroform OD
memiliki dua bahan kimia bioaktif yang mampu secara khusus
menghambat perkembangan sel kanker payudara. Zat ini adalah asam
ursolic (UA) dan oleanolic (OA), sebagai ditentukan oleh 1H dan13C
NMR [16].

Kedua triterpenoid pentasiklik ini terbukti mengurangi viabilitas sel

pada sel kanker payudara MCF-7 sekaligus meningkatkan ekspresi p53
dan p21WAF1/Cip1 (jalur non caspase). Selanjutnya, OA dan UA
memiliki dampak penghambatan yang kuat pada sel yang resisten
terhadap tamoxifen (obat umum untuk kanker payudara), menunjukkan
bahwa bahan kimia ini mungkin berperan dalam payudara tumor yang
mengembangkan resistensi hormone.

OA dan UA memiliki struktur kimia yang serupa dan satu-satunya

perbedaan antara kedua senyawa tersebut adalah posisi gugus metilnya;
UA memiliki gugus metil pada C19 sedangkan gugus metil OA pada
terikat pada C20.
C. Ekstraksi dan Pemisahan Senyawa p-coumaric acid dan ferulic acid

Extraction of p-Coumaric Acid and Ferulic Acid Using Surfactant-Based Aqueous Two-
Phase System
Introduction Asam ferulat (FA) dan asam para-koumarat (pCA) memiliki
banyak potensi dalam industri kesehatan, makanan, farmasi,
dan kosmetik [1, 2]. FA memiliki kemampuan untuk
melindungi dari penyakit koroner dan menurunkan kadar
kolesterol [1, 2] sedangkan pCA adalah kemoprotektan dan
memiliki sifat antioksidan [3].

Asam fenolik banyak ditemukan pada bagian tumbuhan yang

mengandung banyak lignoselulosa. Ekstraksi yang disukai oleh
asam fenolat adalah alkaline hidrolisis.

Surfactant-based cloud-point extraction adalah metode yang

relatif baru yang belum dieksplorasi untuk ekstraksi FA dan
pCA. Surfactant-based cloud-point extraction (CPE)
menggunakan prinsip polimer termoseparasi yang membentuk
dua fase terpisah (fase kaya surfaktan dan fase berair) dengan
meningkatkan suhu (lebih besar atau sama dengan suhu titik
awan surfaktan) atau meningkatkan konsentrasi surfaktan (lebih
besar atau sama dengan konsentrasi misel kritis). Surfaktan
bersifat amfifilik, yaitu memiliki bagian hidrofobik dan
hidrofilik. Kelompok hidrofilik (ionik atau sangat polar)
menentukan kelarutan molekul dalam air dari surfaktan. Sifat
amfifilik tergantung pada sifat molekul seperti berat molekul,
blok relatif ukuran, urutan blok, dan parameter termodinamika
(seperti suhu dan tekanan). CPE berbasis surfaktan memiliki
banyak keunggulan seperti koefisien partisi yang tinggi,
pengurangan volume proses yang signifikan, faktor pengayaan
yang tinggi, tidak ada kehilangan gula, dan biokompatibilitas
[14, 16]. Langkah – langkah umum CPE :
 1. Pemilihan Surfaktan : Pilih surfaktan yang sesuai untuk
membentuk sistem dua fase (fase kaya surfaktan dan fase
air) di atas suhu tertentu yang dikenal sebagai suhu titik
awan atau dengan mencapai konsentrasi misel yang kritis.
2. Persiapan Larutan Ekstraksi : Siapkan larutan ekstraksi
dengan melarutkan surfaktan dalam pelarut yang sesuai
pada konsentrasi di atas konsentrasi misel kritis.
3. Penambahan Sampel : Tambahkan sampel yang
mengandung senyawa target (seperti asam ferulat dan asam
p-koumarat) ke dalam larutan ekstraksi.
4. Pemanasan : Panaskan larutan hingga suhu di atas suhu
titik awan surfaktan, menyebabkan pemisahan fase menjadi
fase kaya surfaktan dan fase berair.
5. Pemisahan Fase : Biarkan fase-fase tersebut terpisah,
biasanya dengan mendinginkan larutan kembali hingga di
bawah suhu titik awan, yang mengarah pada pembentukan
dua lapisan yang berbeda.
6. Pengumpulan Fase Kaya Surfaktan : Kumpulkan fase kaya
surfaktan yang mengandung senyawa target yang
diekstraksi.
7. Analisis : Menganalisis fase yang terkumpul untuk
mengukur dan mengonfirmasi keberadaan senyawa yang
diekstraksi.
8. Pemulihan : Jika diperlukan, senyawa target dapat
dipulihkan dari fase kaya surfaktan dengan menggunakan
teknik yang tepat.

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan khusus untuk

mengekstraksi FA dan pCA dari tongkol jagung menggunakan
CPE berbasis surfaktan. Tongkol jagung merupakan sumber
baik untuk asam fenolat dibandingkan dengan batang jagung.
Selain itu, surfaktan yang berbeda (L92, Triton X-114, Triton
X-100, Triton X-45) dieksplorasi dalam penelitian ini. Selain
itu, hidrolisis alkali digunakan untuk pengolahan tongkol
jagung karena efektif dalam melepaskan FA dan pCA secara
selektif dari lignoselulosa [17].

Bahan Kimia HPLC-grade acetonitrile (purity 99.8 %) was obtained from SD

Fine Chemicals (Mumbai, India). D-Glucose (extrapure AR),
 FA (98 % pure), pCA (AR), and 3,5-dinitrosalicylic acid
(extrapure AR) were purchased from Sisco Research
Laboratories Pvt., Ltd. (Mumbai, India). Triton X-45 (Sigma)
and Triton X-114 were purchased from Sigma-Aldrich
Chemicals (India). L92 (equivalent PE9200) was kindly
provided by BASF, Mumbai, India. L92 is a pluronic diblock
functional copolymer (PPO-PEO) having a molecular weight of
3,650 g/mol. Deionized water from an in-house facility was
used for all the experiments. Acetic acid (99.5 %) was obtained
from Lobachemie (Mumbai, India).
Metodologi I. Alkaline Hydrolisis
1. Perlakuan Awal Tongkol Jagung : Tongkol jagung
digiling, dan partikel yang lebih kecil dari 1 mm dipilih
untuk diproses lebih lanjut.
2. Pengaturan Hidrolisis Basa : Tongkol jagung yang
telah digiling diperlakukan dengan NaOH pada
konsentrasi mulai dari 0,5 hingga 4 N. Rasio padatan
terhadap cairan yang digunakan adalah 0,084 g tongkol
jagung per gram larutan NaOH.
3. Kondisi Reaksi : Reaksi hidrolisis alkali dilakukan
selama 6 jam pada suhu kamar dalam labu kocok.
NaOH bertindak sebagai katalisator dalam memecah
tongkol jagung.
4. Sentrifugasi : Setelah periode hidrolisis 6 jam, seluruh
campuran disentrifugasi dengan kecepatan 4.000 rpm
selama 20 menit untuk memisahkan residu padat dari
fase cair.
5. Pengumpulan Supernatan : Supernatan, yang
mengandung komponen terlarut dari tongkol jagung,
dikumpulkan untuk analisis dan pemrosesan lebih
lanjut.
6. Penyesuaian pH : Sebelum ekstraksi asam ferulat dan
asam p-koumarat, pH hidrolisat alkali disesuaikan
menjadi 3,0 menggunakan 2 M HCl.
7. Analisis : Hidrolisat dianalisis untuk mengetahui
keberadaan asam ferulat, asam p-koumarat, dan gula
untuk menentukan efisiensi proses hidrolisis basa.
8. Proses Ekstraksi : Proses ekstraksi untuk sistem model
dan hidrolisat alkali melibatkan metode yang sama,
seperti yang dijelaskan dalam prosedur ekstraksi FA
 dan pCA.

II. Extraction of FA and pCA

1. Persiapan Larutan Ekstraksi : Tambahkan surfaktan ke
dalam fase air atau hidrolisat dalam tabung sentrifugasi
15 mL.
2. Pencampuran : Campur larutan dengan kuat untuk
memastikan penyebaran surfaktan secara menyeluruh.
3. Pemanasan : Tempatkan tabung di dalam penangas air
mendidih dan panaskan larutan selama 5 menit.
4. Sentrifugasi : Segera setelah pemanasan, sentrifugasi
tabung pada 9.000 rpm selama 5 menit untuk
menginduksi pemisahan fase.
5. Pemisahan Fase : Sentrifugasi menghasilkan
pembentukan dua fase - fase kaya surfaktan dan fase air.
6. Pengumpulan Supernatan : Kumpulkan supernatan
(lapisan atas) dengan hati-hati untuk analisis lebih
lanjut, yang kemungkinan besar mengandung senyawa
yang diekstraksi.
7. Parameter Eksperimental : Prosedur ini dilakukan untuk
mempelajari efek konsentrasi surfaktan (mulai dari 1%
hingga 9% v/v), tingkat pH (disesuaikan dari 1 hingga 9
menggunakan larutan HCl dan NaOH), dan kombinasi
surfaktan pada efisiensi ekstraksi.
8. Eksperimen Rangkap Dua : Semua percobaan dilakukan
dalam rangkap dua untuk memastikan reproduktifitas
dan keandalan hasil.

III. Kuantifikasi Ekstrak FA dan pCA ( HPLC)

1. Instrumentasi : Analisis dilakukan dengan
menggunakan sistem HPLC DIONEX Ultimate 3000
yang dilengkapi dengan kolom C-18 fase terbalik
(Acclaim 120) berukuran 4,6 mm × 250 mm dengan
ukuran partikel 0,5 μm. Detektor array dioda
digunakan untuk mendeteksi senyawa pada panjang
gelombang 320 nm.
2. Fase Gerak : Fase gerak terdiri dari 20% asetonitril
dan 80% air (dengan asam asetat 1%) untuk
memfasilitasi pemisahan FA dan pCA. Komposisi fase
gerak ini membantu dalam mencapai pemisahan dan
 deteksi yang optimal dari senyawa target.
3. Laju Aliran : Fase gerak dialirkan dengan laju alir 1,0
mL/menit melalui kolom selama analisis kromatografi.
4. Persiapan Sampel : Sebelum analisis, sampel hidrolisat
alkali yang mengandung FA dan pCA dinetralkan
menggunakan HCl 2 N untuk menyesuaikan pH.
Sampel kemudian disaring melalui filter 0,22 μm
untuk menghilangkan materi partikulat yang dapat
mengganggu analisis HPLC.
5. Deteksi : Senyawa FA dan pCA dideteksi berdasarkan
waktu retensi dan absorbansi pada 320 nm
menggunakan detektor array dioda.

Result and Discussion

Effect of Surfactants - Ekstraksi maksimum (90,8% b/b FA, 91,7% b/b pCA)
and Its Concentration on dicapai oleh surfaktan pluronic L92.
FA and pCA Extraction - Triton X-114 memperoleh efisiensi ekstraksi sebesar
74,7% FA; 76,3% pCA
- Triton X-100 memperoleh efisiensi ekstraksi sebesar 57%
FA; 60,7% pCA
- Peningkatan efisiensi ekstraksi signifikan hingga
konsentrasi surfaktan 5% (v/v)
- Baik FA maupun pCA bersifat hidrofobik; oleh karena itu,
surfaktan yang memiliki lebih banyak komponen
hidrofobik akan menunjukkan ekstraksi yang lebih baik
daripada yang lain.
Effect of pH on - Pengaruh pH pada ekstraksi FA dan pCA dipelajari dari
Extraction of FA and yang sangat asam hingga basa (1,0 hingga 9,0)
pCA - Efisiensi ekstraksi maksimum (76-86%) diperoleh pada
nilai pH rendah (1,0 dan 3,0).
- FA dan pCA adalah senyawa yang relatif hidrofobik dan
memiliki kelarutan yang lebih rendah dalam air. Kelarutan
kedua senyawa dalam air disebabkan oleh adanya gugus
COOH- dan OH-
- Pada pH rendah, kedua asam tersebut muncul dalam
bentuk tak terionisasi; oleh karena itu, interaksi dengan
molekul air di sekitarnya lebih sedikit, memaksanya masuk
ke dalam fase kaya surfaktan pada pH rendah (1 hingga 3).
- Pada pH yang lebih tinggi (>5), FA dan pCA hadir dalam
bentuk terionisasi yang meningkatkan interaksi dengan
 molekul air sehingga meningkatkan afinitasnya terhadap
fase berair yang menghasilkan lebih sedikit ekstraksi.

Separation using HPLC Kondisi yang dioptimalkan menghasilkan 85% FA dan 89%
ekstraksi p-CA.

D. Mekanisme Uji Aktivitas Caspase

Antiproliferative and Proapoptotic Activities of Ferulic Acid in Breast and Liver Cancer
Cell Lines
Introduction Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases) adalah keluarga protease,
caspase yang diaktifkan dapat menghancurkan beberapa protein
intraseluler yang penting dan menginduksi apoptosis. Caspase biasanya
terdapat di dalam sitoplasma dalam bentuk zimogen yang tidak aktif.
Banyak faktor yang dapat mengaktifkan aktivitas Caspase. Setelah
enzim Caspase tertentu diaktifkan, serangkaian enzim Caspase lainnya
akan diaktifkan juga. Caspase diekspresikan pada tahap awal dan akhir
apoptosis.

Prinsip : Pengaktifan caspase dapat mengkatalisis substrat AC-IETD-

pNA untuk menghasilkan pNA kuning (pNitroanilin). pNA memiliki
serapan yang kuat di dekat 405 nm, Aktivitas caspase 8 dapat dihitung
dengan menentukan absorbansi pada 405 nm.

Preparasi Sel-sel diperlakukan dengan dua konsentrasi FA (100 dan 200 μg/mL)
Sel/Jaringan untuk menilai aktivitas caspase-8 dan caspase-9.
a. Sel diinkubasi di atas es dengan buffer lisis sel (50 μL) selama 15
menit untuk melisiskan sel dan mengekstrak komponen seluler.
b. Setelah lisis, lisat sel disentrifugasi pada 10.000 x g selama 10
menit pada suhu 4°C untuk memisahkan supernatant sel dari
ekstrak sitosol yang mengandung caspase-8.
c. Ekstrak sitosol kemudian digunakan untuk uji aktivitas caspase-8
 dan caspase-9.

Uji Aktivitas Ekstrak sitosol yang diperoleh dari sel yang dilisiskan digunakan untuk
Caspase-8 dan menilai aktivitas caspase-8 dan caspase-9 sebagai respons terhadap
Caspase-9 pengobatan FA.
a. Ekstrak sitosol dipindahkan ke microplate 96 sumur pada
konsentrasi 100-200 μg protein total dalam 50 μL Cell Lysis
Buffer per sumur.
b. Buffer reaksi yang mengandung 10mM Dithiothreitol (DTT)
ditambahkan ke dalam sumur, bersama dengan substrat spesifik
IETD-pNA untuk caspase-8 atau LEHD-pNA untuk caspase-9.
c. Substrat spesifik IETD-pNA digunakan dalam tes aktivitas
caspase 8 karena meniru situs pembelahan substrat caspase 8.
Ketika caspase 8 aktif, ia membelah substrat IETD-pNA di
tempat yang spesifik, melepaskan p-nitroanilin (pNA) sebagai
produk. Jumlah pNA yang dilepaskan dapat diukur secara
spektrofotometri untuk mengukur aktivitas caspase 8 dalam
sampel.
d. Inkubasi pada suhu 37°C selama 1 – 2 jam, setelah inkubasi akan
terjadi perubahan warna.
e. Kontrol latar belakang tambahan, bebas dari lisat sel,
kemungkinan disertakan untuk memperhitungkan reaksi non-
spesifik.

Pengukuran  Sampel dalam lempeng mikro dibaca pada panjang gelombang

Aktivitas 405 nm menggunakan pembaca lempeng mikro untuk
Caspase mengukur absorbansi.
 Nilai absorbansi yang diperoleh dari sampel digunakan untuk
menghitung aktivitas caspase 8 dan 9 sebagai respons terhadap
perlakuan FA.

 Satu unit adalah jumlah enzim (caspase-8 dan -9) yang akan
membelah 1,0 nmol substrat kolorimetri Ac-IETD-pNA (caspase-8)
dan LEHD-pNA (caspase-9) per jam pada suhu 37°C dalam
konsentrasi substrat jenuh.
E. In – Silico approach via caspase

Caspase Activators: Phytochemicals with Apoptotic Properties Targeting Cancer, a Health

Care Strategy to Combat this Disease
Introduction Caspase, merupakan keluarga endoprotease yang diarahkan
aspartate dan bergantung pada sistein. Caspase berperan dalam
proses inisiasi dan eksekusi apoptosis (kematian sel terprogram).
Caspase disintesis sebagai pro-caspase yang tidak aktif secara
katalitik, mereka diaktifkan pada stimulus apoptosis, seperti
ligan kematian atau permeabilisasi membran mitokondria luar.

Caenorhabditis elegans, merupakan organisme yang banyak

digunakan dalam penelitian biologi. Pada C. elegans, caspase
pertama diidentifikasi yaitu, CED-3, yang berperan penting
dalam prorses apoptosis (kematian sel terprogram). CED-3,
homolog caspase di C. elegans, berfungsi mirip dengan caspase
mamalia dalam memulai dan melaksanakan apoptosis. Ini
disintesis sebagai pro-enzim yang tidak aktif dan menjadi aktif
sebagai respons terhadap sinyal apoptosis.

Keluarga protease sistein yang berkembang dari homolog CED-

3. Keluarga enzim ini terdiri dari 11 anggota pada manusia dan
mamalia. Mereka diklasifikasikan berdasarkan kapasitas
penginduksi apoptosis yaitu, caspase-3, -6, -7, -8, dan -9.
Caspase yang berperan dalam peradangan pada manusia adalah
caspase-1, -4, -5, -12. Mereka yang memiliki peran inflamasi
pada tikus adalah caspase-1, -11 dan -12. Peran fungsional
caspase -2, -10 dan -14 kurang dikenal. Caspase apoptosis
diklasifikasikan menjadi dua berdasarkan lokasi dan mekanisme
kerjanya yaitu, caspase inisiator (caspase-2, -8, -9, -10) dan
caspase eksekutor apoptosis (caspase-3, -6, -7).

Peneliti telah melaporkan penemuan terkait efek terapeutik

dalam biji, kulit kayu, akar dan daun tanaman/herba tertentu.
Penyaringan ADMET (Absorption, Distribution, Metabolism,
Excretion, and Toxicity). dengan hasil tinggi menyediakan
 paradigma yang efektif untuk menyaring senyawa untuk proses
penemuan obat baru, sehingga dilakukan prediksi interaksi
molekuler antara senyawa – senyawa terhadap protein target.

Molecular docking adalah metode komputasi yang digunakan

untuk memprediksi mode pengikatan dan afinitas pengikatan
molekul kecil (senyawa) terhadap protein target, biasanya
berdasarkan struktur kristalografi sinar-X protein. Dalam
penemuan obat, para peneliti sering kali memiliki pustaka
senyawa yang besar yang perlu disaring untuk mengidentifikasi
kandidat obat yang potensial. Namun, penyaringan kumpulan
data yang begitu besar menggunakan docking molekuler dapat
menjadi sangat intensif secara komputasi dan memakan waktu.
Penyaringan dataset didasarkan pda sifat dan fitur substruktural
senyawa yang sesuai seperti, kelarutan yang baik, permeabilitas,
dan, ketersediaan hayati.

Dengan menggunakan strategi penyaringan dan analisis

keragaman ini, para peneliti dapat secara efektif mengurangi
dataset yang akan berlabuh, memfokuskan sumber daya
komputasi pada senyawa yang lebih mungkin berinteraksi
dengan baik dengan protein target dan menunjukkan sifat
farmakologis yang diinginkan.
Material Penelitian ini bertujuan untuk mengkompilasi literature ilmiah
tentang tanaman tradisional yang memiliki potensi antikanker,
terutama melalui jalur apoptosis dengan pengaktifan caspase.
Tinjauan ini mengumpulkan informasi dari berbagai sumber
seperti Google, Google Scholar, Research Gate, dan NCI,
dengan fokus pada publikasi dari tahun 1997 hingga 2017.
Metodologi
Docking Molekuler 1. Preparasi Protein Caspase
Fitokimia dari Protein target yang dituju pada penelitian ini adalah caspase-
Tanaman Obat 8 dari kompleks Homo sapiens dengan DARP (protein
Menggunakan pelepas dopamin). Protein 2Y1L atau kompleks caspase-8
Autodock dengan DARP dapat di download dari PDB atau protein data
bank.
2. Preparasi Ligan
Sejumlah 82 fitokimia dari tanaman obat tradisional suku
kani dipilih dari survei literature. Beberapa fitokimia ini
disaring untuk aktivasi caspase-8 melalui teknologi in silico,
 sebanyak 16 fitokimia dipilih untuk analisis docking.
Struktur ligan di unduh melalui website Pubchem.
3. Molecular Docking
Molecular docking dilakukan menggunakan software Swiss
Doc dari perangkat lunak Lead IT. Analisis dan visualisasi
dilakukan menggunakan perangkat lunak Chimera tools,
AMBERff99SB Force, dan Mol2.
4. Minimisasi Energi Protein Target
a. Struktur protein 2Y1L dimuat ke dalam perangkat lunak
BioSolve IT, yang merupakan alat pemodelan dan
simulasi molekuler.
b. Rantai A spesifik dari protein 2Y1L disiapkan dan dipilih
untuk prosedur docking.
c. Identifikasi saku pengikatan (binding pocket) caspase-8
dalam protein 2Y1L, sebagai tempat yang menarik untuk
studi docking. Binding pocket adalah wilayah protein di
mana ligan dapat terikat.
d. Energi pengikatan dari situs yang teridentifikasi dalam
binding pocket diminimalkan. Proses ini melibatkan
pengoptimalan interaksi antara asam amino dalam
binding pocket dengan ligan untuk mencapai konfigurasi
pengikatan yang stabil dan menguntungkan secara energi.
e. Koordinat atom dari asam amino dalam kantong
pengikatan dikonvergensikan, yang berarti bahwa
posisinya disesuaikan untuk memastikan bahwa struktur
protein berada dalam konformasi yang sesuai untuk
simulasi pengikatan.
5. Prediksi Situs Aktif
Situs aktif protein target adalah tempat ligan berikatan. Situs
ini diidentifikasi berdasarkan struktur protein, tempat
pengikatan ligan yang diketahui, atau melalui metode
prediksi komputasi. Binding pocket 2Y1L diidentifikasi
untuk analisis situs pengikatan. Binding pocket terbesar
dipilih untuk studi pengikatan.
6. Simulasi Pengikatan (Docking) : Selama simulasi docking,
ligan secara virtual "dipasang" ke dalam situs aktif protein
target. Perangkat lunak ini mengeksplorasi berbagai orientasi
dan konformasi ligan di dalam situs aktif.
7. Penilaian : Setiap kompleks ligan-target potensial dievaluasi
menggunakan fungsi penilaian yang memperkirakan afinitas
 pengikatan berdasarkan faktor-faktor seperti ikatan hidrogen,
interaksi hidrofobik, interaksi elektrostatik, dan gaya van der
Waals. Penilaian ini membantu menentukan peringkat
konformasi ligan dari yang paling mungkin terjadi di alam.
Result and Discussion
Phytochemicals of I. Molecular docking analysis
Important Kani Tribe
Medicinal
Plants with Apoptotic
Properties Activating
Caspase-8: an in silico
Study

Nilai ∆G (delta G) mewakili perkiraan perubahan energi

bebas yang terkait dengan pengikatan setiap senyawa ke
reseptor 2Y1L. Perubahan energi bebas adalah kuantitas
termodinamika yang merupakan ukuran energi yang tersedia
untuk melakukan pengikatan ligan ke reseptor. Nilai ∆G
negatif menunjukkan bahwa proses pengikatan bersifat
spontan dan menguntungkan secara energi.
- (b) Interaksi eugenol dengan 2Y1L: ∆G = -6,03
kkal/mol
- (c) Interaksi Berberin dengan 2Y1L: ∆G = -6,28
kkal/mol
- (d) Interaksi isoorientin dengan 2Y1L: ∆G = -7,89
kkal/mol
- (e) Interaksi Metoksi Luteolin dengan 2Y1L: ∆G = -7,90
kkal/mol
- (f) Interaksi asam caffoylquinic dengan 2Y1L: ∆G = -
8,19 kkal/mol
- (g) Interaksi brusin dengan 2Y1L: ∆G = -8,94 kkal/mol
- (h)Interaksi artokarpin dengan 2Y1L: ∆G = -9,22
kkal/mol
 Besarnya nilai ∆G dapat ditafsirkan sebagai indikasi
kekuatan interaksi, dengan nilai yang lebih negatif
menunjukkan afinitas pengikatan yang lebih kuat.
Berdasarkan hasil molecular docking, artocarpin tampaknya
memiliki afinitas pengikatan terkuat (paling negatif)
terhadap reseptor 2Y1L, sedangkan eugenol memiliki
afinitas terlemah di antara senyawa yang terdaftar.
II. Swiss ADME results

Tabel ini merupakan ringkasan dari sifat penyerapan, distribusi,

metabolisme, dan ekskresi (ADME) dari berbagai fitokimia.
1. Fitokimia: Kolom ini mencantumkan nama-nama fitokimia
yang sedang dipelajari, bersama dengan spesies tanaman
yang terkait dengannya (MPN: Most Probable Number,
diikuti dengan nama latin tanaman).
2. Lipofilisitas (Log P o/w): Kolom ini menunjukkan nilai log
P, yang menunjukkan lipofilisitas atau kemampuan suatu
senyawa untuk larut dalam lemak, minyak, dan pelarut non-
polar dibandingkan dengan air. Nilai log P yang lebih tinggi
menunjukkan lipofilisitas yang lebih besar.
3. Kelarutan dalam air (Log S (ESOL)): Kolom ini memberikan
perkiraan kelarutan senyawa dalam air, yang dinyatakan
sebagai log S. Nilai yang lebih negatif menunjukkan
kelarutan yang lebih rendah dalam air.
4. Penyerapan gas (GI): Bagian ini dibagi menjadi beberapa
baris yang menunjukkan apakah suatu senyawa cenderung
memiliki penyerapan gastrointestinal (GI) yang tinggi atau
rendah, berdasarkan berbagai aturan atau pelanggaran.
Aturan ini didasarkan pada sifat molekul seperti berat
molekul (MW), luas permukaan kutub topologi (TPSA),
jumlah donor ikatan hidrogen (H-don), dan lainnya.
- Lipinski : Mengacu pada Aturan Lima Lipinski, yang
memprediksi ketersediaan hayati oral yang tinggi pada
manusia. “Ya” menunjukkan bahwa senyawa tersebut
sesuai dengan aturan tersebut, sedangkan “Tidak”
menunjukkan satu atau lebih pelanggaran.
- Ghose : Mirip dengan Lipinski, tetapi dengan parameter
yang berbeda untuk memprediksi kemiripan obat.
- Muegge : Satu set kriteria lain untuk mengevaluasi
kemiripan obat.
- BA : Skor ketersediaan hayati (bioavailability), dengan
nilai yang lebih tinggi menunjukkan potensi ketersediaan
hayati yang lebih baik.