Tugas Teknik Laboratorium Ketiga

Disusun oleh : Nabila Daneta Putri 1706983212

Pertanyaan dan jawaban :

1. Apakah yang dimaksud penelitian In Vitro?

a. Ialah teknik penelitian yang dilakukan dengan mikroorganisme, sel atau molekul di luar dari asalnya
(biasanya di dalam lingkungan buatan seprti tubes, cawan petri dsb).
b. Penelitian secara in vitro memungkinkan peneliti untuk mengisolasi sel, bakteri, virus, dan
memelajarinya tanpa distraksi atau melihat keceluruhan organisme tersebut.
c. Kelemahan dari in vitro : tidak dapat merepresentasikan kehidupan yang sesungguhnya secara tepat.

2. Untuk tujuan apa saja kultur sel dilakukan?

Kultur sel dilakukan untuk tujuan memproduksi kuantitas besar dari tipe sel yang menarik sebagai kultur
murni sehingga dapat dilakukan percobaan lebih lanjut, seperti :
- mempelajari interaksi antar sel, produk dan sekresi sel
- mempelajari efek toksik suatu zat terhadap berbagai sel tubuh
- menentukan obat-obatan dan terapi yang sesuai untuk suatu penyakit
- terapi gen
- mereplikasi virus (dalam pembuatan vaksin)
- mempelajari interaksi antara sel dengan agen penyebab penyakit
- mempelajari aktivitas intraselular, seperti sintesis protein, diferensiasi, dan apoptosis
- mendeteksi dan mengisolasi virus

3. Apa prinsip dari kultur sel?

Terdapat enam prinsip, yaitu :
1. jaminan kualitas semua bahan dan metode, serta penggunaan dan penerapannya, untuk menjaga
integritas, validitas, dan reproduksi dari setiap pekerjaan yang dilakukan
2. dokumentasi dari informasi yang diperlukan untuk melacak bahan dan metode yang digunakan, untuk
memungkinkan pengulangan pekerjaan, dan untuk memungkinkan para pembaca memahami dam
mengevaluasi pekerjaan
3. pembentukan dan pemeliharaan langkah-langkah yang memadau untuk melindungi individu dan
lingkungan dari potensi bahaya
4. kepatuhan dengan hukum dan peraturan yang relevan, dan dengan prinsip-prinsip etika
5. penyediaan pendidikan dan pelatihan yang relevan dan memadai untuk semua personel untuk mengingat
kualitas kerja keselamatan
6. pembentukan dan pemilharaan pemahaman yang memadai tentang sistem in vitro dan faktor-faktor yang
relevan yang dapat memengaruhinya

4. Bagaimana suatu kultur sel dapat menggambarkan fungsi fisiologis dan efek suatu material terhadap sel
eukariotik?
- Kultur sel mengandung inti sel yang identik dengan sel tubuh sehingga mengandung informasi genetik
(berupa DNA) yang serupa juga.
- Informasi genetik tersebut berperan dalam proses sintesis protein yang berpengaruh terhadap kondisi
fisiologis maupun patologis pada sel

5. Jika anda ingin melakukan kultur primer dari jaringan rongga mulut, dari mana saja jaringan itu dapat
diambil?
Referensi :
1. https://www.researchgate.net/publication/332845263_Overview_of_the_different_methods_used_in_th
e_primary_culture_of_oral_mucosa_cells
2. https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/154405910708600203
 - Epitel oral terdiri dari jaringan yang diklasifikasikan dalam kategori stratified epithelia. Keratinizing
epithelium dan non-keratinizing epithelium dapat dibedakan dalam jaringan ini.
- Mukosa oral menunjukan jaringan epitel dan jaringan ikat pada area yang berbeda pada rongga mulut.
Jaringan epitel terdiri dari keratinosit dan jaringan ikat sebagian besar terbentuk dari fibroblast.
- Fibroblast biasanya diisolasi dari lapisan dermal kulit atau dengan oral mucosal biopsy, sementara
keratinosit bisa didapatkan dari berbagai situs di rongga mulut seperti palatum durum, gingiva, atau
mukosa bukal.

6. Bagaimana cara menghitung sel hasil kultur?

Referensi : https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer

Hemocytometer terdiri dari 4 kamar (set) hitung, setiap kamar hitungnya terdiri dari 16 kotak
Prosedur kerja:
1. hemocytometer dibersihkan dengan alkohol 70% , basahi coverslip dengan air dan tempelkan ke
hemocytometer
2. Aduk tabung secara perlahan untuk memastikan sel-sel terdistribusi secara merata
3. Sebelum sel mengendap, keluarkan 0,5 mL suspensi sel menggunakan pipet steril 5 mL dan letakkan
dalam tabung Eppendorf.
4. ambil 100 μL sel ke dalam tabung Eppendorf baru dan tambahkan 400 μL 0,4% Trypan Blue (konsentrasi
akhir 0,32%). Campurkan perlahan
5. gunakan pipet, ambil 100 μL Trypan Blue sel suspensi dan aplikasikan pada hemocytometer, secara
perlahan isi kedua ruang dibawah coverslip, suspensi akan tertarik karena kapiler aksi.
6. gunakan mikroskop, fokuskan ke grid lines dari hemocytometer dengan perbesaran lensa objektif 10x
7. hitung sel yang tidak berwarna (sel hidup tidak menyerap warna trypan blue) dalam 1 set 16 kotak.
hitung juga sel yang berwarna (sel mati)
8. geser hemocytometer ke set selanjutnya, dan sampai 4 set selesai dihitung.
9. untuk menghitung jumlah viable cells/mL
- rata-ratakan jumlah sel dari setiap set
- kalikan dengan 10000
- kalikan dengan 5 untuk koreksi pengenceran 1:5 dari trypan blue

7. Jika ingin memperoleh stem sel/sel punca yang berasal dari rongga mulut dari mana sumbernya
diperoleh dan bagaimana prosedurnya?

Sumber Stem Cell Rongga Mulut

1. Gingival → Gingival fibroblastic stem cells (GCFs)
2. Dental follicle → Dental follicle stem cells (DFSs)
3. Pulpa → Dental pulp stem cells (DPSCs)
4. Apical papilla → stem cells from apical papilla (SCAP)
5. Ligament periodontal → periodontal ligament stem cells (PDLSCs)
6. Situs implant dental → Dental implant stem cells (DISCs)
7. Stem cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth (SHED)
 Prosedur
1. berikan antibiotik profilaktik 1 jam sebelum ekstraksi dan mouthwash antiseptik tepat sebelum ekstraksi
2. usapkan betadine di sekitar kulit/mukosa
3. ekstraksi gigi dengan hati-hati tanpa merusak mahkotanya
4. segera pindahkan ke dalam container
5. cuci gigi dalam ethanol 70% dengan mencelupkannya dalam Tube I
6. bilas gigi dalam larutan phosphate buffered saline yang mengandung antibiotik (100 IU/ml Penicillin dan
100 μg/ ml Streptomycin dengan mencelupkannya 5-7x (tergantung ukuran gigi) ke dalam Tube II untuk
menghilangkan ethanol
7. pindahkan gigi ke dalam Tube III untuk proses lebih lanjut
8. tambahkan 2 mL tooth preservation cocktail (TPC) pada gigi di Tube III
9. biarkan selama 5 menit
10. tambahkan 1 mL nourishment medium pada TPC dalam Tube III
11. Seal Tube dengan paraffin film setelah proper labelling
12. transport Tube III ke cell processing laboratory sebelum 48 jam dalam suhu ruangan

8. Alat apa saja yang umum dipergunakan untuk melaksanakan kultur? Sebutkan dan apa gunanya?

Referensi :
a. Vanderbilt.edu. (2020). CellCultureBasicEU. [online] Available at:
https://www.vanderbilt.edu/viibre/CellCultureBasicsEU.pdf [Accessed 19 Feb. 2020].
b. https://www.labcompare.com/General-Laboratory-Equipment/318-Laboratory-Pumps/
c. https://www.britannica.com/technology/pH-meter

Basic Equipment
- Cell culture hood: digunakan untuk menciptakan lingkungan yang steril pada percobaan kultur sel.
Peralatan ini penting sebagai penahan cipratan infeksi atau aerosol yang dihasilkan oleh banyak
prosedur mikrobiologis serta mencegah kontaminasi kultur sel
- Incubator: menyediakan kondisi lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan sel, seperti suhu, tingkat
kelembaban, dan tingkat CO2 yang terkendali dan stabil
- Water bath: diperlukan dalam memfasilitasi kultur sel untuk menghangatkan media dan reagent lain
yang digunakan untuk sel
- Centrifuge: digunakan secara rutin dalam kultur jaringan sebagai bagian dari subculture routine untuk
sebagian besar cell lines dan persiapan sel untuk cryopreservation.
- Inverted microscope: mikroskop yang digunakan untuk pengamatan specimen dan jaringan hidup
- Refrigerator: sebagai tempat penyimpanan sel kultur yang kecil, biasanya domestic refrigerator
digunakan untuk menyimpan reagen pada 2-8°C.
- Freezer: untuk penyimpanan reagen pada suhu 5-20°C
- Cell counter: untuk mengukur jumlah dan viabilitas sel (sel hidup dan sel mati) secara akurat dalam
waktu tertentu
- Liquid nitrogen (N2) freezer or cryostorage container: menggunakan nitrogen cair atau karbon dioksida
sebagai media pendingin dan berupa cabinet atau liquid immersion
- Autoclave: untuk menstrerilisasi material yang terkontaminasi

Expanded Equipment
- Aspiration Pump (peristaltic or vacuum) : untuk mengaspirasi sampel atau untuk mereduksi tekanan uap
seperti pada instrument rotary dan oven, tergantung dari jenis aspiration pump.
- pH meter : untuk mengukur aktivitas ion hidrogen didalam larutan
- Confocal microscope : untuk melihat gambaran histologi / histopatologi / atau sitologi dari suatu
preparat.
- Flow Cytometer : teknologi berbasis laser yang digunakan untuk menganalisa ekspresi permukaan sel
dan intraselular molekul, melihat karakteristik serta membedakan tipe tipe sel dalam populasi sel yang
 heterogen, menilai kemurnian dari isolasi subpopulation dan menganalisa bentuk dan volume sel.
Memungkinkan untuk menganalisa multi-parameter secara simultan pada satu sel.

Additional Supplies
- cell culture vessels (e.g Flasks, petri dishes, roller bottles, multi-well plates) : berguna untuk menjaga
cultures dari kontaminasi lingkungan luar dan secara bersamaan menjaga lingkungan internal.
- pipettes and pipettors: digunakan untuk memindahkan cairan
- syringe dan needles : digunakan untuk menginjeksikan cairan
- waste containers : untuk membuang benda yang tidak digunakan lagi
- media
- sera/serum
- reagent : zat yang ditambahkan untuk melihat adanya reaksi atau tidak dengan zat tersebut
- cells

9. Bagaimana kita tahu bahwa sel yang kita kultur dalam wadah kultur itu hidup?
Referensi :
1. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. Biologi Molekuler Sel. Ed 2. Terj. Kantjono AT.
Jakarta: Gramedia, 1994: 73, 165, 255-7
2. Ryan JA. Introduction to Animal Cell Culture. http://209.85.175.104/search?q=cache:qvQ3REydVvsJ: www.
corning.com/
Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_culture.pdf+Introduction+to+
Animal+Cell+Culture&hl= id&ct+clnk&cd=1&gl=id. 10/07/07
3. Freshney RI. A Manual of Basic Technique. Culture of Animal Cells. 4th ed. New York: Willey-Liss; 2000. p.
1-6, 78, 89-104, 309-12, 29-37

- Pada sel yang masih hidup, sel tersebut dapat menampilkan sifat-sifat yang sesuai dengan lingkungan
yang asli. Kehidupan sel dalam kultur sel yaitu proliferasi sel dan sekresi protein oleh sel ke dalam
medium kultur.
- Untuk mengetahui sel yang dikultur itu masih hidup, ialah dengan cara :
o Menguji viabilitas sel. Viabilitas sel dapat memberikan informasi kemugkinan sel untuk dapat
hidup dengan menunjukkan respon sel jangka pendek atau segera seperti perubahan
permeabilitas membran atau gangguan pada jalur metabolisme tertentu.
o Melihat dari mikroskop.
▪ Jika wadah kultur digoyangkan, sel masih melekat pada wadah kultur berarti sel masih
hidup.
▪ Jika wadah kultur digoyangkan, sel sudah tidak melekat pada wadah kultur, bentuknya
sudah berubah menjadi membulat kembali, berarti sel sudah tidak hidup.

10. Jelaskan secara singkat prosedur kultur sel primer!

Referensi: https://www.creative-bioarray.com/support/primary-cell-culture-guide.htm
Prosedur kultur sel primer, yaitu :
1. Isolation : Merupakan tahap mulai dari mempersiapkan jaringan yang akan diisolasi dan menempatkannya
di pada culture dish
2. Primary Culture & Subculture : Setelah penyemaian awal kultur primer, ubah medium setelah 24 jam. Lihat
kultur di bawah mikroskop untuk memastikan kondisi kultur dan melakukan subculture pada waktu yang
tepat
3. Cryopreservartion : Lihat kultur di bawah mikroskop untuk memastikan kondisi kultur. Apabila sekitar 90%
kultur tumbuh aktif, maka direkomendasikan untuk melakukan ctyopreserving sel primer