Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids,

Colony Formation Assays

Pendahuluan
Kanker disebabkan oleh terjadinya mutasi seluler yang pembelahannya tidak terkontrol
dan tahan terhadap sistem kekebalan tubuh. Sel kanker dapat menimbulkan gangguan terhadap
fungsi fisiologis tubuh, seperti pencernaan, saraf, sistem peredaran darah, dan jaringan tubuh
lainnya. Walapun telah dikembangkan berbagai macam penelitian, kanker tetap menjadi penyakit
utama yang menyebabkan kematian di seluruh dunia. Penemuan obat baru terus dikembangkan
untuk meningkatkan efek klinis yang ditimbulkan terhadap sel kanker.
Penemuan obat baru terhadap sel kanker, hanya sampai tahap pengujian efek terapeutik
yang ditimbulkan dengan menggunakan kultur sel monolayer 2D, sehingga sulit divalidasi uji
klinisnya. Oleh karena itu, diperlukannya pengembangan pemodelan sel kanker yang lebih baik,
mirip seperti aslinya secara in vivo. Perkembangan terbaru, pemodelan sel kanker telah berhasil
membentuk sel 3D.
Pendekatan teknik kultur sel 3D dapat meningkatkan potensi hidroksikumarin OT486
yang dikombinasikan dengan BH3 sebelum dilakukan pengujian secara in vivo. Metode yang
digunakan menggabungkan uji koloni dan SFA sebagai pembentukan sel kanker yang
dimodelkan pada ikan zebra untuk memvalidasi efektivitas dari kombinasi OT486 dan BH3 pada
sel kanker paru-paru.
Pemeriksaan pembentukan koloni (CFA) secara rutin dilakukan untuk menilai efektivitas
sebagai agen antikanker yang baik. Pengujiannya, melihat kemampuan sel dalam berproliferasi
dan membentuk koloni. Efek dari agen antikanker pada koloni ditentukan berdasarkan penurunan
jumlah atau ukuran koloni tersebut.
Spheroids yang merupakan pemodelan sel kanker secara in vitro, merupakan agregat sel
tersuspensi yang tumbuh atau tertanam dalam matriks 3D. Tujuan pendekatan ini untuk
menskrining obat dan pertumbuhan sel kanker beserta proliferasi dan interaksi imun yang
ditimbulkan. Sel kanker yang dikembangkan pada ikan zebra (Danio rerio) merupakan
pendekatan kultur sel 3D lain yang dikembangkan secara in vivo dan vertebrata.
Secara keseluruhan, dilakukan tiga pendekatan 3D terhadap efektivitas antikanker dari
hidroksikumarin OT486 yang dikombinasikan dengan BH3 pada model sel kanker paru dengan
metode CFA, SFA, dan pembentukan sel kanker secara in vivo pada ikan zebra.

Metode
A. Colony Formation Assay
1. Kultur sel A549 pada konsentrasi 20,000 sel/cm2 dalam 15 mL RPMI1640 media
pertumbuhan sel dengan 10% PBS dan antibiotik 1% dalam tabung 75 cm2 dengan CO2
diinkubasi pada suhu 37ºC dan CO2 5%.
 2. Hari pengujian, konsentrasi sel diukur menggunakan hemositometer. 50.000 sel
disentrifugasi kecepatan 400 x g untuk 7 menit dalam tabung mikrosetrifus 1,5 mL dan
diresuspensi 100 μL sel dengan 1x PBS steril (Phosphate Buffered Saline) dalam tabung
1,5 mL.
3. Dispensi 1,1 mL medium semi-padat metilselulosa (MCBM) dalam tabung 15 mL
dengan multipipet. Tabung disiapkan dengan kondisi yang berbeda..
4. Ditambahkan 110 μL FBS ke 1,1 mL MCBM menggunakan mikropipet P200.
5. Biji sel jumlah 1.000 sel/mL. Dipipet suspensi sel 2,4 μL dari larutan stok (50.000 sel
dalam 100 μL 1x PBS) menggunakan mikropipet P2 dan ditambahkan 1,1 mL MCBM
yang mengandung 10% FBS.
6. Setelah sel ditambahkan, tabung divortex selama 1 menit, dipegang secara vertikal, sel
akan tercampur dengan MCBM dengan kecepatan tinggi.
7. Ditambahkan senyawa uji (OT48 sendiri atau dalam kombinasi dengan A1210477).
Siapkan tabung terpisah sebagai kontrol untuk pelarut yang digunakan (dimetil sulfoksida
(DMSO)). Volume yang ditambahkan tergantung pada konsentrasi senyawa dan kontrol
pelarut untuk setiap kondisi.
8. Tabung divortex selama 1 menit.
9. Untuk setiap pengujian, ditambahkan 1 mL campuran dengan mikropipet P1000 ke dalam
sumuran dan cawan kultur sel.
10. Sumuran kosong diisi 1 mL air steril atau 1x PBS untuk menstabilkan kelembapan.
11. Lempeng kultur diinkubasi selama 10 hari dalam inkubator pada suhu 37ºC dan CO2 5%.
12. Setelah 10 hari, ditambahkan 200 µL larutan MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium
bromide) (5 mg / mL) ke masing-masing sumuran mencapai konsentrasi 1 mg/mL.
13. Diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37ºC dan CO2 5%. Koloni akan berubah warna
menjadi ungu.
14. Difoto menggunakan kamera dengan latar berwarna putih, gambar disimpat dengan
format tiff.
15. Jumlah koloni yang baik dihitung menggunakan perangkat lunak ImageJ. Dipilih menu
"Image | Type | 8 bit". Pilih menu "Adjust | Threshold". Tetapkan ambang ke kontrol dan
konstan untuk semua kondisi; Pilih menu "Analyze | Analyze Particles". Simpan data dan
analisis dengan perangkat lunak statistik untuk representasi grafis.

B. Spheroid Formation Assay

1. Kultur sel A549 pada konsentrasi 20.000 sel/cm2 dalam labu 75 cm2 dengan 15 mL
RPMI 1640 serta medium yang mengandung FBS 10% dan antibiotik 1%.
2. Pada hari percobaan, disiapkan pelat U-bottom 96.
3. Lempeng dengan 10.000 sel dalam sumuran yang sudah mengandung senyawa penarink
(50 μM OT48 dan/atau 20 μM dari A1210477). Volumenya akhir disesuaikan hingga 100
μL pada medium kultur sel. Jumlah sel yang membentuk spheroid seragam dengan batas
luar dianggap cukup untuk membentuk spheroids.
 4. Dinkubasi selama 3 hari dalam inkubator pada suhu 37°C dan CO2 5%.
5. Setelah diinkubasi selama 3 hari, diambil gambar spheroid menggunakan mikroskop
cahaya dengan pembesaran 4x.

Pembahasan
Tingkat pembentukan koloni dengan metode Colony Formation Assays (CFA) diperoleh
dengan MCBM tergantung pada jenis sel yang digunakan. Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa OT48 tidak tidak menghasilkan jumlah penurunan koloni secara signifikan, tetapi jika
dikombinasikan dengan BH3A1210477 menghasilkan penurunan kemampuan sel A549 secara
signifikan. Sebelumnya, turunan hidrokumarin OT52 yang dikombinasikan dengan BH3 dapat
menghambat kemampuan pembentukan koloni sel A549. CFA dengan MethoCult merupakan
teknik yang digunakan untuk mengukur tumorgenesis dalam berbagai macam kanker, tetapi
memilik keterbasan, sering terjadi perubahan pemulihan sel setelah percobaan dan sel kanker
tidak tumbuh baik setelah diisolasi dari MCBM pada media RPMI 1640. Tetapi, CFA
merupakan teknik praklinis yang dapat diterima untuk memahami mekanisme perkembangan
kanker dalam kondisi 3D. Kondisi pertumbuhan 3D secara akurat mewakili lingkungan
pembentukan sel kanker secara alami secara in vivo. Namun, metode CFA sangat lambat, teknisi
melakukan percobaan secara intensif dan tidak cocok digunakan untuk menghasilkan skrining
yang tinggi.
Spheroids Formation Assays (SFA) dilakukan dengan menggunakan sel penyokong dan
memperoleh penemuan obat kanker sehingga menunjukkan perubahan ciri fisiologi, seperti
peningkatan kelangsungan hidup sel, perubahan morfologi kanker dan inti hipoksia secara in
vivo. Ukuran, tekstrur dan integritas spheroids yang diperoleh menggunakan tektik pelat U dapat
memberikan variasi antar sel. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa OT48 yang
dikombinasikan dengan BH3 dapat menghambat integritas dan mengurangi pembentukan sel
spheroids A548. Sebelumnya telah dilaporkan penghambatan spheroids A548 oleh hidrokumarin
kombinasi dengan BH3. Keuntungan utama dengan menggunakan ini, yaitu menghasilkan
reproduktifitas dan efektivitas biaya yang tinggi. Tetapi, salah satu keterbatasan menggunakan
teknik spheroids adalah pemindahan kolompok sel ke kultur suspensi tidak dapat ditoleransi
dengan baik, karena disebabkan oleh berbagai kelompok sel. Untuk meningkatkan penyaringan
senyawa, seperti sistem 3D, beberapa perusahaan mengembangkan substrat spesifik dan
meningkatkan rancangan pembentukan struktur 3D. Dengan kemajuan teknis dan pengembangan
model sel kanker 3D representatif lebih banyak akan memungkinkan pemahaman yang lebih
baik tentang farmakologi senyawa baru untuk jenis kaker tertentu.