TUGAS PRATIKUM IV FARMASI DAN TERAPI

PENGENALAN TEKNIK STEM CELL

“ Memperoleh Sel Punca Mesenchymal Dari Jaringan Adiposa Murin Asal:

Studi Eksperimenta “

Oleh :

ELSI ENJELS SINAMOHINA

1709010044

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS NUSA CENDANA

KUPANG

2020
1. Judul terapi pengobatan dengan teknik stem cell
“ Memperoleh Sel Punca Mesenchymal Dari Jaringan Adiposa Murin Asal: Studi
Eksperimenta “
2. Sumber stem cell yang digunakan
Jurnal Internasional Penelitian dan Transplantasi Sel Punca ( IJST) ISSN: 2328-3548
3. Mengapa jenis stem cell tersebut yang digunakan.
AD-MSCs dan Derived Mesenchymal Stem Cells (BM-MSCs) memiliki
karakteristik yang sama dalam hal plastisitas. Keuntungan dari jaringan adiposa
adalah bahwa sumbernya lebih mudah diakses dan menawarkan MSC dalam jumlah
besar dengan teknik bedah yang tidak terlalu invasif. MSCs diperoleh dari jaringan
adiposa subkutan tikus Wistar. Pertama-tama kontrol mikrobiologi dilakukan untuk
mengecualikan keberadaan bakteri atau jamur di jaringan. Jaringan adiposa
difragmentasi secara mekanis dan enzimatis dan fraksi sel stomal disemai dalam labu
kultur yang melekat pada DMEM 20% FBS. Setelah 48 jam, media diganti. Sel
dikarakterisasi dengan mengevaluasi: 1) kemampuannya untuk melekat pada plastik;
2) potensi klonogenik dengan uji Colony Forming Unit (CFU); 3) kemampuannya
untuk berdiferensiasi dalam 3 garis keturunan mesodermal (adiposit, osteosit, dan
kondrosit). AD-MSCs mampu berdiferensiasi dalam adiposit, osteosit dan kondrosit
sebagaimana dikonfirmasi oleh pewarnaan Oil Red'O, pewarnaan von Kossa dan
analisis histologist.
4. Objek dalam penelitian
 Jenis hewan yang digunakan adalah tikus jenis wistar yang rata-rata beratnya
350g.
 Jumlahnya sebanyak 20 ekor dan jenis kelamin dari tiukus tersebut adalah
jantan. kondisi kondisi tertentu sesuai keinginan peneliti. Tujuan penelitian ini
adalah untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi Adipose Derived
Mesenchymal Stem Cells (AD-MSCs) untuk mengevaluasi potensi proliferasi
dan kemampuannya untuk berdiferensiasi pada tipe sel yang berbeda.
5. Bahan dan metode
 Isolasi MSC dari Jaringan Adiposa
Lemak subkutan diperoleh dari 20 ekor tikus jantan jenis Wistar yang
rata-rata beratnya 350g. Semua hewan dibius dengan injeksi midazolam
intramuskular dan anestesi dipertahankan dengan isofluran dan campuran gas
oksigen yang diberikan dengan masker. Untuk pengadaan jaringan adiposa
dilakukan sayatan kecil sekitar 2 cm di pangkal paha hewan. Melalui tumpu
diseksi, lemak dipisahkan dari lapisan otot dan akhirnya dipotong. Kulit ditutup
dengan jahitan terputus tunggal. Sampel jaringan adiposa dibawa ke laboratorium
ke dalam kotak steril yang berisi HBSS (larutan garam seimbang Hanks; Gibco)
yang dilengkapi dengan antibiotik 5%. Setelah 1 jam pemulihan jaringan, sampel
diproses dalam kondisi steril. Sebelum memulai prosedur isolasi sel, dilakukan
kontrol sterilitas pada jaringan adiposa dengan menggunakan media bakteri dan
jamur spesifik seperti Blood-Agar, Plate Count Agar (PCA) e Agar Sabouraud
untuk memastikan tidak terjadi peristiwa kontaminasi selama pengambilan
sampel.
Pertama-tama sampel jaringan adiposa dicuci secara ekstensif (sekitar 3
kali) dengan HBSS yang diperkaya 2% penicillin-streptomycin untuk
menghilangkan kotoran dan darah. Potongan tersebut kemudian ditimbang dan
ditempatkan dalam pelat petri 90 mm dengan 15-20 ml larutan garam yang
diperkaya penisilin-streptomisin untuk secara mekanis difragmentasi menjadi
potongan-potongan kecil dan selanjutnya dicuci dengan larutan garam. Sampel
yang sudah difragmentasi kemudian dimasukkan ke dalam labu berisi
larutan0,2% kolagenase tipe IA dalam PBS (20 ml kolagenase per gram jaringan
adiposa untuk dicerna) ditambah dengan 1% antibiotik (penisilin, streptomisin
dan amfoterisin). Penguraian enzimatik dilakukan dalam penangas termostatik
pada suhu 37 ° C sambil diaduk selama 2-3 jam sampai matriks ekstraseluler
rusak total dan fraksi seluler terlepas.Media kultur sel standar yang terdiri dari
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dengan 10% FBS dan 1%
penicillin-streptomycin kemudian ditambahkan untuk menetralkan aktivitas
enzim. Jaringan yang dicerna disaring dengan kain kasa steril, ditempatkan dalam
tabung 50 ml dan disentrifugasi pada 2700g selama 10 menit pada suhu kamar.
Supernatan karena itu disedot dan pelet sel yang diperoleh disuspensi
ulang dalam 10 ml medium lengkap (Dulbecco glukosa rendah + 20% SFB + 1%
antibiotik-antimikotik), disentrifugasi 2 kali pada 1400g selama 10 menit pada
suhu kamar untuk menghilangkannya. larutan enzimatik sisa.Setelah berputar,
suspensi sel disuspensi kembali dalam 10 ml medium lengkap, disaring melalui
saringan sel (ukuran pori 70 μm) dan disentrifugasi. Kontrol sterilitas dilakukan
 lagi seperti yang dijelaskan di atas untuk memastikan bahwa tidak ada peristiwa
kontaminasi yang terjadi selama prosedur isolasi.Suspensi sel yang diperoleh
ditambahkan DMEM 3ml dan sel dihitung dalam Burker Camera dengan
menggunakan Trypan Blue. Sel-sel kemudian dilapisi dengan ukuran 25 cm 2
labu kultur dalam medium DMEM-Low Glukose yang dilengkapi dengan
glutamin, serum sapi janin (FBS) dan 1% penisilin-streptomisin.
Kultur dipelihara dalam inkubator dengan atmosfir lembab yang
mengandung 5% CO 2 inkubator memiliki suhu konstan 37 ° C, ideal untuk sel
manusia dan hewan, dan kelembapan relatif 100% untuk mencegah penguapan
media kultur.Media diganti setelah inkubasi selama 48 jam untuk menghilangkan
fraksi yang tidak melekat, terdiri dari sel hematopoietik, debris, dan jenis sel lain
yang tidak dapat menempel pada plastik. Ketika sel mencapai 80% pertemuan,
subkultur dilakukan dengan menggunakan enzim trypsine-EDTA untuk
menghilangkan sel-sel yang melekat dari labu.Identitas AD-MSCs telah
diverifikasi oleh kemampuannya untuk menempel pada permukaan plastik labu
kultur, membentuk CFU (unit pembentuk koloni) dan berdiferensiasi menjadi sel-
sel dari garis keturunan mesodermal: kondrosit, adiposit dan osteosit. Kehadiran
faktor transkripsi yang mengindikasikan pembaruan diri dan ketidakterbukaan
juga diselidiki.
 CFU Assa
Efisiensi pembentukan koloni pada plastik diuji dengan pelapisan sel
terisolasi pada tiga kepadatan benih yang berbeda (150, 60 dan 30 sel / cm). 2)
dalam piring 6-lubang di DMEM Glukosa Rendah dengan 5% FBS. Sel diinkubasi
selama 2 minggu dalam inkubator dengan humidifikasiudara dan 5% CO 2. Koloni
diwarnai dengan larutan Giemsa dan dicetak.
 Diferensiasi AD-MSCs (Osteogenesis, Chondrogenesis dan Adipogenesis)
Sel yang berasal dari lemak subkutan dan viseral dan diperluas dalam medium
DMEM Glukosa Rendah dengan 20% FBS digunakan untuk studi diferensiasi.
MSCs dibiakkan dalam media diferensiasi yang sesuai untuk mendapatkan 3 garis
keturunan mesodermal (osteoogenik, kondrogenik dan adipogenik). Semua
penelitian dilakukan dengan jumlah kontrol yang sama.
 Kondrogenesis
 Kultur mikromassa sel (1 × 10 6 sel / ml) diinkubasi dalam tabung reaksi 15
ml dengan Medium NH Chondro Diff (Mylteny Biotec) selama 30 hari, dengan
penggantian medium setiap 3 hari sekali. Massa mikro difiksasi dan diwarnai
dengan hematoksilin-eosin
 Adipogenesis
Sel dilapisi pada 7500 sel / cm 2 pada piring 6-sumur, dan diolah dengan
Media Adipogenik MesenCult Lengkap (Teknologi Stemcell) selama 21 hari
dengan penggantian medium setiap 3 hari sekali. Pewarnaan Oil Red O digunakan
untuk memeriksa pembentukan tetesan lipid
6. Hasil penelitian dan pembahasan
 Isolasi dan Kultur Mesenchymal StemCells dari Jaringan Adipose
MSC berhasil diisolasi dari jaringan adiposa; mereka mencapai
semiconfluence (80%) dalam 25 cm 2 labu dalam 5-6 hari, mempertahankan
penampilan fibroblastoid yang khas. Kami dapat memperoleh jumlah sel yang
signifikan (3x10) dalam 5-6 hari dari satu sampel jaringan adiposa. Subkultur
dibuat sampai memungkinkan untuk mengamati pemeliharaan fenotipe
karakteristik dan tingkat vitalitas yang cukup besar dalam budaya. Untuk beberapa
sampel dapat diamati pertumbuhan sel sampai bagian kesepuluh, sampel lainnya
diamati sampai subkultur kelima.
 Kontrol Mikrobiologis
Kontrol mikrobiologi, dilakukan pada sampel jaringan adipose dan pada sel
yang dilakukan setelah protokol ekstraksi, negatif untuk kontaminasi oleh bakteri
dan jamur. Oleh karena itu telah dipastikan bahwa pengadaan jaringan dan
penanganan kultur sel dilakukan dalam kondisi steril.
 Karakterisasi MSCs
a. CFU Assay
Uji klonogenik untuk menguji efisiensi sel dalam kultur dilakukan
pada semua sampel di bagian sel 1, 3, 5. Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa MSCs mempertahankan kemampuan klonogenik (gambar 1).
b. Diferensiasi MSC.
MSCs yang diisolasi menunjukkan kapasitas diferensiasi terhadap tiga
jalur sel mesodermal osteocitic, adipocytic, condrociti.
c. Osteogenesis
 MSC yang dibudidayakan di OsteoDiff Medium menunjukkan fenotipe
kuboid, terus berkembang biak secara aktif dan membentuk agregat sel.
Setelah pewarnaan "von Kossa" pada sel yang diinduksi untuk berdiferensiasi,
terlihat deposisi matriks ekstraseluler terkalsifikasi, ditampilkan dalam warna
hitam, berasal dari pengendapan garam perak (gambar 2). Dalam sel kontrol,
diwarnai dengan media pemeliharaan, fenotipe tidak berubah.
d. Kondrogenesis
Pembentukan agregat tiga dimensi diamati pada tabung di dasar kerucut yang
mengandung NH ChondroDiff Me- dium, (gambar 2a) tetapi tidak pada
tabung kontrol dengan konsentrasi sel yang sama dalam media pemeliharaan.
Pewarnaan hematoksilin-eosin, dilakukan pada bagian nodul yang dipasang
pada kaca objek, menunjukkan bahwa sel memperoleh organisasi struktural
yang mirip dengan tulang rawan (gambar 2b).
e. Adipogenesis
Setelah 4-5 hari, MSCs dikultur dalam Media Adipogenik dengan
MesenCult, membentuk banyak akumulasi lipid di sitoplasma (gambar 3a).
Peningkatan ukuran tetesan lipid diverifikasi dalam pengamatan selanjutnya.
Pada hari ke 21 setelah induksi diferensiasi Oil Red O dan pewarnaan
hematoxylin dilakukan untuk menyoroti inti sel dalam warna biru dan
timbunan lemak dengan warna merah (gambar 3b). Tidak ada diferensiasi
yang diamati pada sel kontrol (gambar 3c). Sel induk mesenkim yang diisolasi
dari jaringan adiposa menunjukkan potensi proliferasi yang tinggi dalam
kultur dan kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi jenis sel yang berbeda.
Jaringan adiposa hampir tersebar di mana-mana, retribusi memberikan teknik
invasif minimal dan merupakan. Sumber sel punca yang secara fenotip
sebanding dengan MSC sumsum tulang, hingga kini terkenal sebagai sumber
pilihan terbaik untuk suplai sel punca autologus.
 Gambar 1. (a) Koloni yang dihasilkan oleh MSC yang terisolasi. Perbesaran 5X,
pewarnaan Von Kossa pada MSCs dipertahankan dalam NH Oste-oDiff Medium
selama 21 hari. (b) Pembesaran 5X (c) Pembesaran 10X. Bintik hitam menunjukkan
pengendapan garam perak.

Gambar 2. (a) pembentukan agregat tiga dimensi dalam tabung di dasar kerucut yang mengandung
pewarnaan NH ChondroDiff Me- dium (b) hematoksilin-eosin, dilakukan pada bagian nodul yang
dipasang pada kaca objek pada perbesaran 5X dan c) 20X.
 Gambar 3. (a) akumulasi lipid dalam sitoplasma MSCs setelah kultur 4-5 dalam Media
Adipogenik dengan MesenCult (b) Minyak Merah O dan pewarnaan hematoksilin setelah 21
hari menyoroti inti sel dalam warna biru dan timbunan lemak dalam warna merah (c) sel
control.

Tujuan penelitian ingin mempelajari karakteristik MSC yang diisolasi dari jaringan
adiposa subkutan tikus Wistar. Sel dikarakterisasi dengan menilai kepatuhan terhadap bahan
plastik, morfologi seperti fibroblast, potensi klonogenik dan potensi diferensiasi dalam garis
sel mesodermal. MSCs yang diisolasi mempertahankan morfologi fibroblastoid khas mereka
dan proliferasi konstan untuk setidaknya 5 bagian dalam media kultur basal. gency; di Italia
sekitar 5 juta orang terpengaruh dan ada10.000 kasus baru setiap tahun. Penyakit ini sebagian
besar disebabkan oleh kerusakan sel endotel ginjal yang menghambat reperfusi dan
pemulihan fungsi organ. Setelah pelanggaran iskemik, Endothelial Progenitor Cells (EPCs)
berpindah dari Bone Marrow (BM) ke lokasi yang rusak. Namun, subjek yang terkena gagal
ginjal kronis, telah kehilangan kemampuan regenerasi sel progenitor kidney dan BMnya yang
menjadi aplastik. Untuk alasan ini, penting untuk menemukan sumber sel alternatif yang
dapat memulihkan situs yang rusak dan kami akan menyelidiki peran AD-MSC.
 DAFTAR PUSTAKA

Cannella V, et al., (2014) Memperoleh Mesenchymal Stem Cells dari Adipose Tissue
of Murin Origin: Experimental Study. Transplantasi Res Sel Punca Int J. 2