Penghambatan Siklus Sel dan Induksi Apoptosis Ekstrak Daun

Vernonia amygdalina Del. pada Garis Sel MCF-7

Abstrak
TUJUAN: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik, penghambatan siklus
sel, dan induksi apoptosis pada ekstrak etil asetat daun Afrika Vernonia amygdalina Del. pada sel
kanker MCF-7.
METODE: Ekstraksi daun Vernonia amygdalina Del. dilakukan dengan metode maserasi
sedangkan sitotoksik dilakukan dengan uji MTT. Setelah itu dilakukan pengujian siklus sel dan
induksi apoptosis dengan menggunakan flow cytometry assay.
HASIL: Nilai IC50 ekstrak n-heksana, etil asetat, dan etanol Vernonia amygdalina Del. pada sel
kanker MCF-7 berturut-turut adalah 206,211 ± 0,99, 50,365 ± 0,07, dan 967,033 ± 2,68 µg/mL.
Hasil persentase siklus sel fase G0-G1 pada sel kontrol sebesar 72,08% menurun pada perlakuan
dengan ekstrak etil asetat 1/2 IC50 sebesar 62,58% dan 1/5 IC50 sebesar 44,72%. Untuk fase S
dan G2-M persentase tertinggi terdapat pada perlakuan ekstrak etil asetat 1/5 IC50 sebesar
47,27% dan 9,50% lebih tinggi dibandingkan sel kontrol sebesar 23,26% dan 5,90%.
KESIMPULAN: Berdasarkan hasil penelitian, ekstrak Vernonia amygdalina Del. memberikan
kemopreventif sebagai anti kanker. Studi masa depan kami akan menilai mekanisme fraksi etil
asetat dalam menghambat angiogenesis dan metastasis pada kanker payudara.

Pendahulan
Kanker adalah pertumbuhan sel abnormal yang dapat menyerang jaringan tubuh normal
dan mempengaruhi tubuh fungsi. Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi risiko kanker
payudara, seperti penggunaan hormon dalam jangka panjang, pola makan faktor reproduksi,
faktor reproduksi dan kehamilan pertama pada suatu usia tua, kurang aktivitas fisik, hormone
terapi penggantian pada pasien kronis, dan faktor genetik bawaan yang berhubungan dengan
payudara kanker, seperti mutasi gen dan radiasi selama perkembangan kanker payudara Masuk
dan berkembangnya sel melalui siklus sel dikendalikan oleh perubahan tingkat dan aktivitas
sekelompok protein bernama siklin. Siklus sel terdiri dari beberapa fase yaitu fase Gap 1 (G1), S
(Sintesis), Gap 2 (G2), dan M (mitosis). Durasi siklus bervariasi. Di dalam sel manusia normal,
siklusnya memakan waktu 20-24 jam dimana fase G1 memakan waktu 8-10 jam, fase S
membutuhkan waktu 6-8 jam, fase G2 membutuhkan waktu 5 jam, dan fase M membutuhkan
waktu 1 jam. Waktu generasi untuk kultur sel umumnya sama dengan sel normal.
Sel juga akan mengalami kematian terkendali seperti respon fisiologis sel untuk
mengeliminasi sel yang tidak dibutuhkan oleh tubuh disebut apoptosis. Apoptosis juga berperan
dalam memantau perubahan sel kanker dan menjadi lini pertama pertahanan untuk melawan
mutasi dengan membersihkan DNA abnormal sel yang dapat bersifat ganas. Jadi, apoptosis
adalah bagian dari sistem kekebalan tubuh yang mengontrol sel normal populasi dalam tubuh.
Secara umum, pengobatan kanker masih bergantung pada kemoterapi yang berasal dari
bahan kimia sintetik. Namun, senyawa kimia dapat menyebabkan efek resistensi multi obat.
Selain itu, anti kanker dengan senyawa kimia sintetik akan mempengaruhi tidak hanya sel target
tetapi juga sel normal di sekitarnya.
Vernonia amygdalina Del. yang merupakan keluarga Asteraceae berasal dari Afrika
Barat. Beberapa penelitian ditemukan beberapa komponen kimia, seperti seskuiterpen lakton
flavonoid, steroid, lemak asam dan saponin [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] dan menunjukkan
beberapa aktivitas farmakologi, seperti anti-obesitas, anti-tumor, anti-malaria, anti peradangan,
dan aktivitas lainnya [12], [13], [14], [15]. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi
sitotoksik aktivitas n-heksana, etil asetat, dan etanol ekstrak daun Vernonia amygdalina Del.
Pada penelitian ini dilakukan uji sitotoksik untuk menentukan nilai IC50 yang
menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan 50%. proliferasi sel dan
mencerminkan toksisitas obat sel MCF-7 [16]. Tes dilakukan untuk menganalisis pertumbuhan
sel dan temukan fase siklus sel pada penelitian yang mengalami pertumbuhan pada fase G2. Pada
fase G2, DNA yang rusak akibat paparan zat atau senyawa karsinogenik akan diperbaiki. Jika
DNA yang rusak tidak bisa diperbaiki, akan terjadi apoptosis pada sel. Itu siklus sel dan tes
apoptosis dilakukan menggunakan metode sitometri aliran.

Alat dan Bahan

Daun segar Vernonia amygdalina Delile dikoleksi dari kebun tanaman obat di Fakultas
Farmasi Universitas Sumatera Utara, Jl. Tridharma Provinsi Sumatera Utara, Indonesia.
Vernonia amygdalina Delile diidentifikasi oleh Herbarium Bogoriense, Kebun Raya Bogor,
Bogor, Indonesia. Bahan kimia yang digunakan adalah Sorafenib, DMSO (Sigma), [3-(4,5-
dimethyl thiazole-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide] (MTT) (Sigma), dan Annexin V
(Biolegend). Kit Propidium Iodida (Biolegend).
Proses pembuatan ekstrak daun Vernonia amygdalina Delile dilakukan dengan metode
maserasi bertingkat. Lima ratus gr simplisia ditimbang dan dimasukkan ke dalam wadah. Pada
maserasi pertama, simplisia direndam dengan 5 L n-heksana selama enam jam, diaduk sesekali,
dan didiamkan selama 18 jam. Setelah itu filtrat dipisahkan dari residu. Residu kemudian
dikeringkan dalam oven pada suhu 50°C. Residu yang telah kering dimaserasi kembali dengan 5
L pelarut etil asetat, direndam selama 6 jam sambil sesekali diaduk, dan didiamkan selama 18
jam. Filtrat kemudian dipisahkan dari residu. Setelah kering residu dimaserasi kembali dengan
pelarut etanol 96% dengan prosedur yang sama. Masing-masing pelarut direndam sebanyak 3
kali. Maserasi dari ketiga pelarut diuapkan dengan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak
kental. Penelitian ini menggunakan etil asetat sebagai pelarut karena sifatnya sebagai pelarut
semi polar yang dapat menarik senyawa polar dan nonpolar.
Sel-sel diperlakukan dengan n-heksana, etil asetat, ekstrak etanol, dan sorafenib. Sel 4T1
ditanam pada microplate 96 well sehingga diperoleh densitas 1 x 104 sel/mL, dan sel diinkubasi
selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah 24 jam, media diganti
dengan yang baru. Setelah itu larutan uji ditambahkan dengan berbagai rangkaian konsentrasi
menggunakan cosolvent DSMO dan diinkubasi pada suhu 37°C dalam inkubator CO2 5%
selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dikeluarkan, dan sel dicuci dengan
PBS. Kemudian, 100 μL media kultur dan 10μL MTT 5 mg/mL ditambahkan ke dalam masing-
masing sumur. Untuk mengamati viabilitasnya, sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam
inkubator CO2 5% pada suhu 37°C. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper (10% SDS
dalam HCl 0,1 N), dan plate dibungkus dengan alumunium foil agar tidak tembus cahaya pada
suhu kamar dan didiamkan selama satu malam. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan
membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang
595 nm.
Sel MCF-7 (5 x 105 sel/mL) dilapiskan pada pelat 6 lubang dan diinkubasi selama 24
jam. Sel-sel diperlakukan dengan ekstrak etil asetat Vernonia amygdalina Del. dan sorafenib dan
kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, media dipindahkan ke dalam tabung
berbentuk kerucut, dan 0,025% trypsin ditambahkan ke dalam cawan. Setelah dicuci dua kali
dengan PBS dan terkumpul ke dalam conical, media disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm
selama 5 menit. Supernatan kemudian dibuang, tetapi 70% etanol dingin ditambahkan ke dalam
sedimen selama 2 jam untuk fiksasi sel. Setelah ditambahkan dengan PBS dan disentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm selama 3 menit, supernatan dibuang, kit PI yang berisi 40 µg/g/µmL
PI dan RNAse 100 mL ditambahkan ke dalam sedimen, dan disuspensikan kembali. Selanjutnya,
campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Sampel dianalisis menggunakan
FAC Scan Flow cytometer. Berdasarkan kandungan DNA-nya, persentase akumulasi sel pada
siklus sel (G1, S, dan G2/M) dihitung menggunakan modfit lt.3.0
Sel MCF-7 (5 x 105sel/mL) disepuh dalam pelat 6 sumur, diinkubasi selama 24 jam,
diberi perlakuan dengan EEAL dan sorafenib, dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam,
media dimasukkan ke dalam tabung berbentuk kerucut, dan tripsin 0,025% ditambahkan ke
dalam sumur. Setelah dicuci dengan PBS, dikumpulkan ke dalam conical, dan disentrifugasi
dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang. Selanjutnya PBS ditambahkan
ke dalam sedimen, dan suspensi disentrifugasi 300 rpm selama 3 menit. Supernatan kemudian
dipindahkan. Selanjutnya kit Annexin V dimasukkan ke dalam microtube, disuspensikan
kembali, dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Sampel kemudian dianalisis
menggunakan FAC Scan Flow cytometer
Data uji sitotoksik dianalisis menggunakan software SPSS 22 dengan analisis probit.

Hasil

Diantara beberapa pelarut uji, hasil uji sitotoksik yang menunjukkan nilai IC50 µg/mL
yang baik untuk sel MCF-7 adalah ekstrak etil asetat. Nilai IC50 yang diperoleh pada sel MCF-7
sebesar 50,365 µg/mL dimana ekstrak etil asetat mampu menghambat 50% pertumbuhan sel
yang diuji pada konsentrasi tersebut.
Analisis penghambatan siklus sel dengan metode flow cytometry dilakukan dengan
pemberian ekstrak etil asetat 1/2 IC50 dan 1/5 IC50. Hasil fase G0-G1 pada kontrol sel adalah
71,08%. Namun persentasenya menurun pada perlakuan dengan ekstrak etil asetat 1/2 IC50
sebesar 62,58% dan 1/5 IC50 sebesar 44,72%. Untuk fase S dan G2-M persentase tertinggi
terdapat pada perlakuan dengan ekstrak etil asetat 1/5 IC50 masing-masing sebesar 47,27% dan
9,50% dimana persentase keduanya lebih tinggi dibandingkan sel kontrol yaitu 23,26% dan
5,90%. Peningkatan penghambatan pada fase S menunjukkan bahwa ekstraksi mencegah sintesis
DNA sel sedangkan peningkatan penghambatan pada fase G2-M menunjukkan adanya perbaikan
DNA yang rusak.
 Persentase induksi apoptosis dari Ekstrak etil asetat daun afrika 1/2 IC50, 1/5 IC50 dan
kontrol sel pada apoptosis awal 1,86%, 4,39%, dan 1,764%, pada apoptosis akhir/nekrosis awal
6,12%, 5,69%, dan 0,62%, dan nekrosis akhir masing-masing adalah 90,56%, 54,36%, dan
7,49%.
Pembahasan
Suatu ekstrak dikatakan berpotensi jika memiliki nilai IC50 kurang dari 100 µg/mL [21].
Semakin banyak jumlah sel hidup menunjukkan semakin aktifnya sel melakukan metabolisme
sehingga jumlah kristal formazan yang terbentuk juga semakin banyak dan menyebabkan
intensitas warna ungu pada plat semakin meningkat. Sel mati tidak dapat diwarnai oleh garam
MTT, sehingga tidak membentuk warna ungu seperti pada sel hidup. Akibatnya sel yang mati
tidak membentuk formazan berwarna ungu, tetapi warnanya tetap kuning seperti medium [22].
Jika DNA yang rusak dapat diperbaiki maka dapat terjadi siklus sel dimana sel memasuki fase
G0-G1 setelah melewati fase M.
Penghambatan siklus G0-G1 memungkinkan terjadinya apoptosis. Oleh karena itu, tidak
ada aktivasi CDK4 dan CDK6 yang mengakibatkan penghambatan fosforilasi pRb (protein
retinoblastoma). Rb yang tidak terfosforilasi berikatan dengan faktor transkripsi E2F yang
berikatan dengan DNA dan menghambat transkripsi gen yang produknya diperlukan untuk siklus
sel pada fase S. Dengan demikian, sel-sel dipertahankan dalam fase G1, atau terjadi penangkapan
G1.
Metode flow cytometry digunakan untuk menentukan apoptosis. Metode ini merupakan
metode yang digunakan untuk menghitung jumlah sel hidup, nekrosis sel, dan apoptosis dalam
waktu singkat. Dalam tes ini, Annexin V digunakan untuk mengikat fosfatidilserin yang
ditemukan di membran plasma sel selama apoptosis fluoresensi.
Potensi ekstrak etil asetat daun Afrika dalam mempromosikan apoptosis sel dapat
disebabkan oleh senyawa steroid/triterpenoid melalui beberapa mekanisme antara lain
penghambatan aktivitas DNA topoisomerase I/II, signal path modulation, penurunan ekspresi
gen Bcl-2 dan Bcl-XL, peningkatan Bax dan ekspresi gen Bak, dan aktivasi endonuclease.
 Berdasarkan hasil, ditemukan bahwa EEAF memiliki efek yang sangat baik; dengan
demikian, ini berpotensi digunakan dalam terapi kanker payudara melalui penghambatan siklus
sel dan aktivitas yang diinduksi apoptosis.