TELAAH JURNAL

Evaluasi efek anti-proliferasi dan anti-migrasi Leucaena leucocephata dan ekstrak etanol
Dolichandrone serrulata terhadap daris sel kanker serviks manusia

Nama : Yenni Al Zahra

NIM : 11194761910449

1. Metode Penelitian
A. Menggunakan metode ekstraksi dengan etanol 95% dimana daun LL dan bunga
DS di kumpulkan lalu di keringkan menggunakan oven udara panas pada suhu 50 ° C
dan di campur menjadi bubuk sehingga tercapai proses ekstraksi. Kemudian koleksi di
proses setelah 7 hari fermentas. Solusinya disaring, diuapkan, dan diliofilisasi dalam
pengering freezer. Etil asetat, kloroform, dan heksana selanjutnya diekstraksi
menggunakan corong pemisah. Semua fraksi dikeringkan dan disimpan masing-
masing pada suhu 50 ° C dan 4 ° C.
B. Penentuan total fenolik konten dengan metode spektrofotometer ultraviolet-terlihat
(UV-VIS)
Senyawa fenolik total (TPC) dilakukan sesuai dengan protokol standar Folin-
Ciocalteu dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, 10% reagen Folin-Ciocalteu
dicampur dengan ekstrak etanol, diikuti oleh 10,75% natrium karbonat dan campuran
diinkubasi dalam suhu kamar selama 30 menit. Pengukuran TPC dipantau pada 765
nm menggunakan spektrofotometer ultraviolet-terlihat (UV-VIS). Hasilnya diwakili
dalam mikrogram setara asam galat per ekstrak miligram (μg ekstrak GAE / mg).
C. Penentuan konten flavonoid dengan metode kolorimetri aluminium klorida (AlCl 3
)
Metode kolorimetri aluminium klorida (AlCl 3 ) dilakukan untuk
mengevaluasi kandungan flavonoid dibandingkan dengan kuersetin. [11] Secara
singkat, 100 mikroliter sampel diinkubasi dengan 2% AlCl 3 selama 45 menit.
Pembentukan kompleks flavonoid-aluminium diukur absorbansi pada 420 nm
menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Kandungan flavonoid dinyatakan sebagai
mikrogram kuersetin ekuivalen per miligram ekstrak (μg setara QE / mg ekstrak).
D. Pengukuran antioksidan dengan menggunakan metode DPPH atau Radikal 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl mengais assay
Kegiatan pembersihan radikal DPPH dilakukan sesuai dengan metode Masuda. [12]
Secara singkat, larutan ekstrak diinkubasi dengan 0,05 mM DPPH pada suhu kamar selama
30 menit dan diamati pada 517 nm menggunakan spektrofotometer UV. Konsentrasi
penghambatan untuk 50% (IC 50 ) menentukan 50% penghambatan radikal DPPH dan
kapasitas aktivitas pembersihan radikal DPPH ditentukan dengan perbandingan Vitamin C
dan Trolox sebagai antioksidan standar.
2,2'-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid scavenging assay
E. Kapasitas ekstrak untuk pengujian radikal daun dilakukan menggunakan 2,2'-
azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) seperti yang ditunjukkan
dalam metode sebelumnya, [13] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, radikal
ABTS diinduksi oleh 7 mM larutan ABTS ditambahkan dalam etanol dengan 2,45
mM kalium persulfat. Pereaksi ABTS disimpan dalam gelap pada suhu kamar selama
16 jam dan diinkubasi dengan 0,1 ml ekstrak selama 30 detik dalam gelap pada suhu
kamar. IC 50 radikal ABTS dihitung membandingkan dengan Vitamin C dan Trolox
sebagai antioksidan standar.
F. Uji kekuatan besi yang mengurangi radikal
Daya pereduksi besi ditentukan menurut metode Benzie [14] dengan beberapa
modifikasi. Secara singkat, larutan ekstrak dicampur dengan reagen daya peredam
radikal (FRAP) yang mengandung 300 mM asetat buffer, 10 mM TPTZ, dan 20 mM
besi klorida dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit di kamar gelap. Produk
ferrous tripyridyltriazine diukur menggunakan spektrofotometer pada 593 nm. Nilai
FRAP dinyatakan sebagai mM ekstrak ferrous sulfate (II) setara/mg.
G. Budaya sel
HeLa, garis sel kanker serviks manusia dikultur dalam modifikasi EMEM
dengan suplemen L-glutamin dengan 10% serum janin sapi, 100 U / ml penisilin, dan
100 U / ml streptomisin dalam inkubator pada 37 ° C dengan 5% CO 2 dan 95 %
kelembaban. Sel-sel dikultur sampai mencapai 80% -90% pertemuan dari pelat sumur
sebelum memulai percobaan.
H. Uji sitotoksisitas dan proliferasi sel
3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide assay Uji
MTT adalah uji kolorimetri untuk menilai viabilitas dan proliferasi sel. Secara
singkat, garis sel HeLa ditempatkan di 96 lubang sumur. Konsentrasi berbeda dari cuti
LL dan ekstrak bunga DS (62,5, 125, 250, dan 500 ug / ml) diinkubasi pada suhu 37 °
C dengan 5% CO 2 selama 24 jam sebelum percobaan secara paralel dengan
kelompok kontrol, doxorubicin (0,625, 1,25, 6,25, 12,5, dan 25 μg / ml) dan Trolox
 (31,5, 62,5, 125, 250, dan 500 μM). Media tanpa suplemen kemudian diganti dan 100
μl 5 mg / ml MTT dalam PBS ditambahkan. Sel diinkubasi 37 ° C dengan 5% CO 2
selama 4 jam. Produk formazan dilarutkan dengan DMSO dan diukur menggunakan
microplate reader pada 570 nm. Nilai sitotoksik sel dinyatakan sebagai persentase
viabilitas sel. Persamaan: Persen viabilitas sel = ([ Sampel OD -OD kosong ] /
[ Kontrol OD –OD kosong ]) × 100.
I. Morfologi sel
Ekstrak tanaman obat dengan konsentrasi yang berbeda (62,5, 125, dan 250 μg / ml),
6,25 μg / ml doxorubicin dan 50 μM Trolox diobati dalam garis sel HeLa. The in vitro
kepadatan sel dan sel morfologi ternoda dengan carmine dan diamati di bawah imager sel
menggunakan lensa objektif 20X dan mikroskop cahaya pada 24 jam.
L. Uji penyembuhan luka
Studi tentang migrasi sel dievaluasi dalam uji penyembuhan luka. Garis sel dikultur
dalam 24 lubang sumur sampai mencapai 90% -100% pertemuan. Luka itu dihasilkan
menggunakan scratcher dengan ukuran 0,5 mm. Alat penggaruk ditekan pada bagian atas
pelat kultur jaringan dan menghasilkan luka vertikal ke bawah melalui monolayer sel
menurut protokol yang dilaporkan dalam penelitian sebelumnya. [15] Sel-sel kemudian
diperlakukan dengan media normal yang digunakan sebagai kelompok kontrol, Trolox (50
atau 200 μM), atau salah satu dari ekstrak herbal dalam konsentrasi 125 dan 250 μg / ml.
Migrasi sel diamati pada 0, 3, 6, 12, dan 24 jam di bawah imager sel. Lebar luka diukur
menggunakan program Image J dan panjang kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
dibandingkan sesuai dengan waktu yang sesuai.
M. Semua variabel dirangkum menggunakan mean dan standar deviasi. Analisis statistik
dilakukan untuk membandingkan antara kelompok dengan Brown-Forsythe Test dan diikuti
oleh koreksi Bonferroni untuk beberapa perbandingan. Statistik signifikan dipertimbangkan
ketika nilai P <0,05 ( R = 3,4.0).

2. Hasil Penelitian
A. Total kandungan senyawa fenolik dan flavonoid
Ekstrak etanol daun DS dan bunga DS diukur untuk kandungan TPC dan
flavonoid menggunakan pelarut yang berbeda (heksana, kloroform, dan etil asetat)
dalam corong pemisah. Kandungan TPC dan flavonoid daun LL sebagian besar
ditemukan pada fraksi etil asetat yaitu 319.290 ± 10,934 μg ekstrak GAE / mg dan
399,572 ± 10,905 μg ekstrak QE / mg, masing-masing [Tabel - 1] . Sebagian besar
kandungan flavonoid ekstrak bunga DS dipantau pada 152.908 ± 23,372 μg setara QE
/ mg fraksi heksana. Gambat tabel :

B. Aktivitas antioksidan
Ekstrak etanol LL dan DS dalam fraksi etil asetat diamati untuk aktivitas
antioksidan menggunakan metode DPPH, ABTS, dan FRAP, seperti yang ditunjukkan
pada [Tabel - 2] . Aktivitas radikal untuk radikal DPPH dan ABTS telah ditunjukkan
di IC 50 setara dengan Vitamin C dan Trolox. Nilai FRAP direpresentasikan dalam
ekuivalen dengan ferro (Fe [II]) dalam perbandingan dengan ekstrak. Hasilnya
mewakili IC 50 . Properti pemulungan yang diamati dengan metode DPPH
menunjukkan IC 50dari 4,917 ± 0,955 dan 36,331 ± 1,683 μg / ml, untuk LL dan DS,
masing-masing. Di sisi lain, setara Trolox dari kedua herbal adalah 27,823 ± 0,361
dan 1,472 ± 0,314 mM TAE / mg, masing-masing. Hasilnya ditunjukkan dengan cara
yang sama ketika dibandingkan dengan Vitamin C dengan 1,472 ± 0,314 dan 0,143 ±
0,032 mg ekstrak Vitamin C ekivalensi / mg, untuk LL dan DS, masing-masing. Hasil
aktivitas pemulungan yang diamati menggunakan metode ABTS ditemukan paling
efektif dalam fraksi etil asetat LL (IC 50 : 11.005 ± 1.491 μg / ml), serta aktivitas
untuk mengurangi Fe 3+ yang hasilnya menunjukkan 3.981 ± 0.262 mM Ekstrak Fe
(II) / mg.

C. Uji sitotoksisitas sel HeLa dengan uji MTT

Lini sel HeLa dirawat di 96 piring biakan sumur selama 24 jam dan
selanjutnya diinkubasi dengan 100 μl 5 mg / ml MTT selama 4 jam dalam inkubator
CO 2 . Persentase viabilitas sel diamati dengan pengukuran produksi formazan pada
absorbansi 570 nm menggunakan pembaca lempeng mikro. Hasilnya menunjukkan
bahwa viabilitas garis sel HeLa secara signifikan dikurangi dalam dosis 250-500 μg /
ml ekstrak LL dan DS bila dibandingkan dengan kontrol [Gambar 1] ; sementara
Trolox, standar antioksidan, tidak menunjukkan statistik yang signifikan dalam
kelayakan sel dibandingkan dengan kontrol.
D. Morfologi sel
Setelah garis sel HeLa diobati dengan media (kontrol), doxorubicin, Trolox
atau ekstrak dalam konsentrasi yang berbeda selama 24 jam, morfologi sel diamati
langsung di bawah pencitra sel dan mikroskop [Gambar - 2] . Hasilnya menunjukkan
karakteristik kematian sel pada kelompok yang diberi doxorubicin dan ekstrak LL dan
DS pada konsentrasi 125 dan 250 μg / ml. Diikuti dengan pewarnaan dengan carmine,
garis sel diperlakukan dengan 6,25 μg / ml doxorubicin, 125 μg / ml LL, dan 125 μg /
ml DS diamati kembali di bawah pencitraan sel dengan lensa objektif 20X [Gambar -
3] . Hasilnya menunjukkan pola kematian sel yang hampir identik antara kelompok
yang diobati dengan doxorubicin dan LL [Gambar - 3] a dan [Gambar - 3] b.
E. Uji penyembuhan luka
Migrasi sel HeLa diamati menggunakan uji penyembuhan luka in vitro dengan
memperkenalkan "luka" menggunakan alat scratcher steril dengan ukuran ujung 0,5
mm seperti yang dijelaskan dalam metode sebelumnya. [Gambar - 4] dan [Gambar -
5] menunjukkan tingkat migrasi sel HeLa dalam kelompok kontrol, Trolox, LL atau
DS pada titik waktu berbeda di bawah pencitraan sel. Menurut perkembangan waktu,
lebar yang dikumpulkan dari kelompok perlakuan media (kontrol) dan kelompok
perlakuan Trolox secara bertahap berkurang [Gambar - 4] dan [Gambar - 5] .
Sementara hasil yang diamati dari kelompok perlakuan LL dan DS menunjukkan
perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan waktu yang sesuai pada kelompok
kontrol [Gambar - 4] dan[Gambar - 5] .