Produk alami, seperti ekstrak tumbuhan, ekstrak terstandar atau senyawa murni, memberikan

banyak peluang untuk penemuan obat baru karena ketersediaan keanekaragaman kimia yang
tak tertandingi [3]. Menurut Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), lebih dari 80% populasi
dunia bergantung pada obat tradisional untuk kebutuhan perawatan kesehatan utama mereka
[4]. Faktanya, obat turunan tanaman telah menjadi dasar sebagian besar farmakope saat ini
[5]. Antara 1981 dan 2006, sekitar 44% dari obat anti-virus yang disetujui adalah produk
alami [6]. Untuk alasan ini, phytochemical semakin penting sebagai sumber potensial untuk
agen anti-virus. Ketika seseorang menganggap bahwa satu tanaman dapat mengandung
hingga ribuan konstituen, kemungkinan membuat penemuan baru menjadi jelas. Faktor
penting untuk keberhasilan utama dari penyelidikan pada konstituen tanaman bioaktif adalah
pemilihan bahan tanaman dan proses ekstraksi dan pemurnian yang sesuai dari senyawa aktif
[7].

L. densium, adalah tanaman roset dari daerah pantai dan dataran garam. Ini dapat mentolerir
berbagai kondisi lingkungan dan tahan terhadap tekanan abiotik seperti garam, suhu tinggi,
dan defisiensi air. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa komposisi kimiawi ekstrak
etanolik pucuk L. densiflum menunjukkan sifat pemulungan dan antioksidan yang sangat
baik [24]. Selain itu, ini merupakan sumber molekul target alami yang kaya dan terus
tumbuh, seperti senyawa fenolik [25]. Senyawa fenolik, terutama flavonoid, telah
mendapatkan banyak perhatian karena aktivitas antioksidan dan kemampuan pembilasan
radikal bebas, yang berpotensi memiliki implikasi bermanfaat dalam kesehatan manusia [25].

Dalam penelitian ini, kami melaporkan aktivitas yang dipandu anti-herpetic fraksionasi serta
karakterisasi molekul yang dimurnikan dari ekstrak hidroetanol L. densium.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan tanaman

L. densiflum (Guss.) Kuntze dikumpulkan di wilayah Sebkha Sidi El Hani di pusat Tunisia
(area salin). Bahan tanaman diidentifikasi oleh Prof Abderrazek Smaoui (Ahli Botani di
Laboratorium Tanaman Ekstrimofil) dan spesimen voucher (PLM30) disimpan di Herbarium
Laboratorium. Tanaman dikeringkan di udara, ditumbuk dan disimpan pada suhu 4 ○ C
sampai ekstraksi.
2.2. Fraksinasi yang dipandu oleh bioassay dan isolasi biomolekul

2.2.1. Ekstraksi

Serbuk L. densiflum (800 g) diekstraksi dengan refluks dengan bagian etanol encer yang
semakin encer (95, 90, 85 dan 80%) selama 1 jam 30 menit setiap kali. Ekstrak disaring dan
dikumpulkan, diuapkan, diliofilisasi, dan kemudian dievaluasi untuk sitotoksisitas dan
aktivitas anti-virus.

2.2.2. Fraksinasi

Ekstrak difraksinasi pada kolom silika gel (tinggi 9 cm. 55 cm) dielusi dengan EtOAc / EtOH
/ H2O (100 / 16,5 / 13,5 v / v / v) untuk mendapatkan 69 fraksi (NB1 hingga NB69).

Menurut elusi mereka oleh TLC, sub-fraksi telah dikumpulkan sebagai berikut: NB 1 hingga
NB10 (F1); NB11 hingga NB17 (F2); NB18 hingga NB27 (F3); NB28 hingga NB33 (F4);
NB34 hingga NB38 (F5); NB 39 hingga NB 49 (F6); NB 50 hingga NB 63 (F7); NB 64 (F8);
NB 65 NB 66 (F9); NB 64 (F10); NB68 NB69 (F11); NB70 (F12).

Subfraksi F9 (1 g), F10 (900 mg), F11 (800 mg), dan F12 (12 g), yang paling aktif,
dikumpulkan dan diserahkan ke fraksinasi kedua pada kolom gel silika (diameter 2 cm.
Tinggi 95 cm) dielusi dengan EtOAc / MeOH / H2O (100: 10: 4) lalu (100: 10: 7) untuk
menghasilkan tujuh sub-fraksi baru (Fr-A hingga Fr-G). Sub-fraksi F2 dipisahkan dengan
kromatografi cair tekanan rendah dengan ETOAC / MeOH (25/1) untuk memulihkan enam
sub-fraksi dari F2-A ke F2-F.

Sub-fraksi Fr-A, Fr-B, Fr-C, F2-A dan F2-B adalah yang paling aktif melawan HSV-1.
Mereka difraksinasi dengan HPLC preparatif (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
menggunakan sistem Agilent 1100. Metode dikembangkan pada kolom analitik (Zorbax
Eclipse C18,

250 × 4,6 mm) dipindahkan ke kolom preparatif (Inertsil prep-ODS, 250 10 mm, ukuran
partikel 5 mm) menggunakan beberapa detektor panjang gelombang dan pengumpul fraksi
otomatis. Kromatogram dipantau pada 280, 254, 210 dan 300 nm.
2.3. Analisis kimia

Sub-fraksi dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT) yang dilakukan pada silika gel
(60 F254, pelat TLC pra-dilapisi, Silicycle, Que'bec, Kanada). Visualiasi dilakukan dengan
menyemprot pelat dengan NP-PEG

(Reagen produk alami / polietilen glikol) dan mengamatinya di bawah sinar UV (365 nm).

Identifikasi struktural senyawa didasarkan pada tes fitokimia dan analisis spektroskopi (UV
dan NMR) dengan perbandingan langsung data dengan sampel otentik atau data referensi.
Spektrum resonansi magnetik nuklir (NMR) nuklir direkam pada spektrometer Bruker
Avance pada 400 MHz (1H) dan 100 MHz (13C), dilengkapi dengan probe QNP 5 mm.
Penjelasan struktur kimia didasarkan pada analisis percobaan 1H, 13C, COZY, HMBC,
HSQC dan DEPT-135. Sinyal dilaporkan sebagai m (multiplet), s (singlet), d (doublet), t
(triplet), dd (doublet of doublet), dt (doublet of triplet), dan br s (broad singlet) dan konstanta
kopling J adalah dilaporkan dalam hertz (Hz). Spektrum serapan UV direkam dengan
Spektrofotometer dioda-array Agilent 8453. Spektrum massa ionisasi elektrospray resolusi
tinggi diperoleh dalam mode positif pada suatu Terapan Biosystems / MDS Sciex QSTAR
XL Q-TOF MS sistem. Spektra HPLC-APCI MS (mode negatif) diperoleh pada sistem
Agilent 1100 series yang terdiri dari degasser, quatpump, injektor otomatis, kompartemen
kolom yang dikendalikan suhu, detektor dioda-array dan detektor selektif massa Agilent
G1946 VL model dilengkapi dengan sumber APCI.

2.4. Evaluasi sitotoksisitas

Viabilitas sel dievaluasi dengan metode 7-hydroxy-3-H-phenoxazin-3-one 10-oxide

(resazurin) [26]. Secara singkat, kultur sel Vero disiapkan dalam 96-well plate,

dengan kepadatan 5 × 103 sel per sumur. Setelah masa inkubasi 24 jam, pada suhu 37 ○ C
dalam atmosfer CO2 5% yang dilembabkan, media kultur dihilangkan dan sel diperlakukan
dengan 200 mL / sumur sampel pada konsentrasi berbeda yang disiapkan dalam media kultur
(1000, 500, 250, dan 125 mg / mL untuk fraksi). Kontrol yang tidak diobati dilakukan dengan
penambahan 200 mL media kultur. Kemudian, sel diinkubasi selama 96 jam. Media telah
dihapus dan 100 mL larutan resazurin (1 mg / mL) ditambahkan. Pelat diinkubasi ulang
selama 2 jam. Setelah itu, larutan resazurin dihilangkan. Fluoresensi dibaca pada 96-well plat
reader Fluoroskan Ascent Fl ™ (Labsystems) otomatis menggunakan panjang gelombang
eksitasi 530 nm dan panjang gelombang emisi 590 nm. Hasilnya dinyatakan sebagai
konsentrasi yang menghambat lima puluh persen pertumbuhan sel (IC50).

2.5. Efek virus dari ekstrak atau senyawa pada HSV-1

Suspensi virus diinkubasi dengan fraksi (6 mg / mL) pada 37 ○ C selama 1 jam [27].
Campuran itu kemudian digunakan untuk menginfeksi sel Vero selama 1 jam. Setelah itu, itu
dihapus; sumur dicuci dengan PBS (pH 7,4) dan diinkubasi dengan metilselulosa / sedang
0,5% selama 72 jam. Setelah 3 hari, media disedot dan sel-sel yang terinfeksi ditutup dengan
formaldehida 10%, diwarnai dengan kristal violet 1%, dan jumlah plak dihitung [28]. Sumur
yang dilapis dengan media tanpa sampel uji digunakan sebagai

kontrol. Persentase penghambatan pembentukan plak lisis (Penghambatan persen IP) dihitung
sebagai berikut: [(jumlah rata-rata plak dalam kontrol) (jumlah rata-rata plak dalam sampel)]
100 / jumlah rata-rata plak dalam kontrol.

4. Diskusi

Dalam sebuah penelitian yang mendefinisikan pelarut "hijau", ditunjukkan bahwa alkohol
sederhana (etanol, metanol) atau alkana (hephane, heksana) adalah pelarut yang lebih disukai
lingkungan dibandingkan dengan dioksan, asetonitril, asam, formaldehida dan tetrahidrofuran
[37 ] Lebih lanjut, ketika membandingkan campuran pelarut, ditunjukkan bahwa campuran
ethanolewater atau methanol-water lebih disukai secara lingkungan dibandingkan dengan
alkohol murni atau campuran propanolewater. Penggunaan campuran pelarut ditemukan
untuk meningkatkan hasil ekstraksi dengan meningkatkan kelarutan dan meningkatkan
interaksi analit yang ditargetkan dengan pelarut ekstraksi [38,39]. Dalam campuran ganda,
satu pelarut dapat meningkatkan kelarutan analit, sementara yang lain akan meningkatkan
desorpsi analit. Dalam konteks ini, air biasanya penting untuk membantu memutus ikatan
matriks dan ikatan matriks (hidrogen). Sebagai contoh, campuran air / etanol mungkin
merupakan sistem pelarut yang paling cocok untuk ekstraksi polifenol bijak karena perbedaan
polaritas konstituen bioaktif, dan penerimaan sistem pelarut ini untuk konsumsi manusia.
Selain itu, meningkatkan pemulihan katein dari daun teh dan biji anggur dan juga senyawa
fenolik dari anggur [40,41].

Dalam penyaringan kami sebelumnya untuk aktivitas biologis tanaman dari rata garam
Tunisia, ekstrak hidro-etanol dari L. Densium menunjukkan aktivitas anti-virus yang menarik
terhadap HSV-1. Untuk alasan ini, fraksinasi yang dipandu secara bio dilakukan untuk
mengidentifikasi senyawa yang bertanggung jawab untuk aktivitas ini. Analisis TLC awal
dari ekstrak kasar mengungkapkan adanya senyawa fenolik (flavonoid) dalam tanaman yang
muncul sebagai bintik-bintik kuning, menggunakan reagen (NPPEG). Intensitas bintik-bintik
kuning ini tampaknya berkorelasi dengan aktivitas anti-virus in vitro. Sampel yang berasal
dari ekstrak oleh sub-misi untuk suksesi kolom kromatografi silika disaring dan aktivitas anti-
herpes yang paling menjanjikan terdeteksi untuk enam sub-fraksi. Akhirnya, tujuh senyawa
diisolasi setelah langkah HPLC preparatif tambahan dan ditandai oleh NMR. Semua senyawa
diidentifikasi sebagai senyawa fenolik. Mereka adalah senyawa aromatik dengan satu atau
lebih gugus hidroksil yang melekat pada cincin aromatik. Mereka termasuk dalam tiga
kelompok: fenolik

asam (asam galat (1)), flavonoid (epigallocatechine gallate (2), quercitrin (3), campuran
myricetin 3-O-a-rhamnopyranoside myricetin 3-O-L-arabinofuranoside

(4) dan dihydrokaempferol (5)) dan kelompok lignan (pinoresinol (6) dan N-trans-ferulolyl
tyramine (7)).

Selama dekade terakhir, potensi manfaat dari flavo-noid dan asam fenolik dalam
pengendalian berbagai penyakit manusia semakin diselidiki [25]. Senyawa fenolik dapat
membantu proses metabolisme pengaturan terhadap penyakit dengan berkontribusi, bersama
dengan vitamin antioksidan dan enzim, ke sistem pertahanan antioksidan total dari tubuh
manusia. Polifenol memiliki kimia struktural yang ideal untuk aktivitas pemulungan radikal
bebas, dan telah terbukti lebih efektif daripada vitamin E dan C pada basis molar [42]. Selain
itu, mereka memiliki aktivitas biologis yang beragam, seperti antiulcerant, anti-inflamasi,
anti-diabetes, anti-virus, sitotoksik dan aktivitas anti-tumor [24]. Di antara isofol polifenol
yang terisolasi

Dengan kandungan L. densiflum, asam galat menunjukkan potensi anti-herpes yang kuat (IP
100% pada 50 mM). Sesuai dengan hasil Kratez et al. [43], asam galat menyebabkan
inaktivasi lengkap virus HSV-1 tanpa adanya sel pada konsentrasi rendah. Selain itu, mampu
menghambat adsorpsi dan penetrasi virus ke sel (nilai IC50 23,9 mM) [43].

Epigallocatechin gallate (EGCG) adalah ester dari epi- gallocatechin dan asam galat dan
menonaktifkan virus HSV-1 pada 50 mM dengan efek langsung pada virion. Faktanya,
inkubasi EGCG dengan sel Vero selama 48 jam sebelum infeksi HSV-1 tidak mengurangi
produksi HSV [44]. Menariknya, beragam virus baik dari kepentingan hewan dan klinis
dihambat oleh gallyl gallate vegetal, termasuk anggota dari Poxiviredea, Asfarviridea dan
Othomixviridea [45].

Secara umum, senyawa fenolik dilaporkan memiliki afinitas tinggi untuk protein, membentuk
kompleks yang tidak stabil. Oleh karena itu, efek anti-virus dari flavonoid dan asam fenolat
pada tahap awal dari siklus HSV mungkin dapat dikaitkan dengan interaksi dengan
glikoprotein amplop virus [46], atau penghambatan polimerase virus dengan konsekuensi
akibat sintesis genom virus [47]. Namun, dalam penelitian ini, campuran myricetin 3-O-a-
rhamnopyranoside myricetin 3-O-L-arabinofuranoside, quercitrin dan dihydrokaempferol
tidak memiliki efek virucidal

pada HSV-1. Ada kemungkinan bahwa kehadiran simultan dari kedua molekul myricetin
mencegah aktivitas. Keberadaan kelompok glikosil di C3 mungkin juga memblokir situs aktif
untuk aktivitas anti-virus. Dalam kasus dihydrokaempferol, dengan perbandingan dengan
kaempferol analog strukturalnya yang menunjukkan aktivitas anti-herpetic yang kuat (IC50
0,4 mg / mL) [48], tidak adanya potensi anti-herpes untuk molekul ini dapat dijelaskan
dengan adanya ganda. menghubungkan antara C2 dan C3 dalam strukturnya. Bahkan
menurut

Limem et al. [49] jumlah gugus hidroksil, senyawa glikosilasi dan ikatan alkena antara C2
dan C3 dari senyawa fenolik semuanya dapat memengaruhi aktivitas biologisnya.

Lignan merupakan kelas besar metabolit sekunder yang dihasilkan oleh dimerisasi oksidatif
dari dua unit fenilpropanoid. Mereka memiliki sifat antikanker dan anti-virus dan secara
spesifik menghambat enzim dan mediator tertentu yang terlibat dalam proses peradangan dan
kekebalan [50]. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pinoresinol, salah satu lignan yang
paling sederhana secara struktural dan tambang-N-trans-ferulolyl menunjukkan aktivitas
virucidal moderat (IP ¼ 26% pada 50 mg / mL) dengan bertindak langsung pada struktur
glyprotein virus.
5. Kesimpulan

Genus Limonium telah dilaporkan mengandung asam fenolik, flavonoid, lignan dan glikosida
fenolik. Sesuai dengan laporan ini, ini adalah laporan pertama dari ekstraksi hijau dan isolasi
senyawa fenolik dari halophyte L. densi fl orum. Aktivitas anti-virus, diukur, menunjukkan
bahwa halofit obat ini mungkin menjadi spesies yang menjanjikan untuk industri farmasi.