OLEH
EUFRALIA MUWA EO (2006070040)
FARAH DIBA ABBAS (2006070023)
THERESIA Y.A LALO (2006070015)
PENGATURAN REAGEN
Pengumpulan sampel Ini adalah langkah pertama dan mungkin lebih sulit dibandingkan ketika
bekerja dengan organisme darat. Hal ini tidak hanya disebabkan oleh kesulitan yang melekat
pada pengumpulan di lingkungan laut tetapi juga karena masalah yang terkait dengan taksonomi
dan kurangnya materi biologis. Fakta ini semakin diperumit oleh kendala yang dihadapi dalam
mencari kondisi yang memadai untuk pertumbuhan dan budidaya invertebrata laut.
Probabilitas menemukan metabolit aktif yang berguna jelas tergantung pada jumlah sampel yang
disaring, sehingga pemilihan sampel yang aktif harus berdasarkan tes primer yang cepat,
ekonomis dan representatif, misalnya, antioksidan (DPPH) dan / atau uji sitotoksisitas (MTT).
Sampai saat ini, hanya beberapa menit jumlah bahan biologis yang harus dikonsumsi, tetapi
setelah diisolasi konstituen aktif dimulai, pengumpulan massal beberapa ratus gram hingga 1 kg
atau bahkan lebih biasanya diperlukan, dan jumlah yang cukup besar bahan terliofilisasi
mungkin diperlukan untuk mendapatkan jumlah yang cukup murni senyawa untuk elusidasi
struktural dan pengujian bioaktivitas. Untuk ini Untuk tujuan ini, ekstraksi selektif, pemisahan
dan prosedur pemurnian24 diikuti seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Jika senyawa murni
menunjukkan hal yang menarik aktivitas biologis, uji farmakologis lebih lanjut (in vitro, in vivo,
toksisitas, dosis yang dapat ditoleransi dan sebagainya) dan studi kimia (struktur modifikasi,
persiapan analog, hubungan struktur-aktivitas dan seterusnya) harus dilakukan untuk memasuki
langkah pengembangan obat baru yang potensial.
Organisme laut dapat diekstraksi dengan menggunakan metanol atau etanol setelah dikumpulkan
dari habitat aslinya atau setelah dikeringkan.Dalam beberapa kasus, bagaimanapun, ekstraksi
bahan segar yang mengandung air laut dengan pelarut organik dapat menyebabkan perubahan
kimiawi senyawa karena konversi katalitik produk alami oleh enzim yang dibebaskan dari
kompartemen penyimpanannya selama proses ekstraksi. Dengan demikian liofilisasi bahan
biologis sebelum ekstraksi dipertimbangkan metode yang lebih disukai.
Umumnya, semua ekstrak laut, fraksi kromatografi dan senyawa murni harus dijauhkan
dari sinar matahari dan sebaiknya disimpan pada suhu 20 1C sebagai ukuran terhadap
potensi kerentanan banyak metabolit sekunder laut terhadap degradasi oksidatif
di udara dan terhadap isomerisasi ikatan rangkap di bawah sinar matahari di kamar
suhu (250C).
Waktu organisme yang baru dikumpulkan disimpan dalam metanol atau etanol tidak
boleh terlalu lama,hindari alkilasi atau esterifikasi, yang menimbulkan artefak teralkilasi
atau ester dari metabolit sekunder.
Komposisinya :
85 ml metanol, 10 ml asam asetat glasial, 5 ml asam sulfat pekat dan 0,5 ml anisaldehida
Asam sulfat pekat harus ditambahkan dalam jumlah yang disebutkan setelahnya
melarutkan atau mengencerkan komponen minor dalam methanol
Semprotkan dengan pereaksi semprotan anisaldehida / asam sulfat dan panaskan hingga
1050C sampai
visualisasi bintik-bintik maksimum. Bintik-bintik dapat berubah menjadi ungu, biru,
merah, abu-abu atau hijau sesuai dengan komponen yang terdeteksi.
Pereaksi semprotan vanilin/asam sulfat
Reagen ini digunakan terutama untuk mendeteksi steroid.
Komposisinya :
85 ml metanol, 15 ml asam sulfat pekat dan 1 g vanillin
Kromatografi lapis tipis dilakukan pada pelat KLT procoated dengan silica gel 60 F254
menggunakan eluen berikut :
1. untuk senyawa polar : EtOAc:MeOH:H2O ( 30:5:4, 30:6:5, 30:7:6 vol/vol )
2. untuk senyawa semipolar : DCM:MeOH ( 95:5,90:10,,85:15,8O:20 atau 70:30 vol/vol)
3. untuk senyawa nonpolar : N-Heksana : EtOAc (95:5,90:10,85:15,8o:20,atau 70:30
vol/vol)
4. TLC pada fase terbalik RP18 F254’,digunakan untuk zat polar dan campuran
MeOH:H(90:10,80:20 atau 60:40)
Garis sel
sel L5178Y Ditumbuhkan dalam media Fischer untuk sel lèùkimia dalam kultur
suspensl
garis sel H4IIE dan C6 ditanam dalam medium Eagle’’s modifikasi Dulbeco yang
mengandung 4,5 g liter -1 glukosa dan 2 ml glutamin dilengkapi dengan serum
janin sapi .Media kultur sel berisi 100 ml
penisiilin dan 100 ml steroptomisindan diganti dua kali seminggu dan 5 % CO2
Kromatografi
kromatograf ikolom fraksi yang berasal dari kromatografi cair vakum ( VLC) dikenai pemisahan
berulang melalui kromatografi kolom menggunakan fase diam yang sesuai dalam system pelarut
fase gerak sebelumnya ditentukan oleh TLC,system pemisahan berikut digunakan :
* Kromatografi fase normal menggunakan fase diam polar biasanya silica gel/diol dengan fase
gerak nonpolar n-heksan
* Kromatografi fase terbalik menggunakan fae diam nonpolar dan fase gerak polar misalnya
H20,MeOH,asetonitril
HPLC
* HPLC analitik digunakan untuk mengidentifikasi distribusi senywa ( terdeteksi sebagai
puncak) baik dari ekstrak maupun fraksi,serta untuk menevoluasi kemurnian senyawa yang
diisolasi.
* HPLC semipreparatif digunkan untuk pemurnian senyawa dari fraksi yang sebelumnya
dimurnikan menggunakan pemisahan kromatografi kolom
Prosedur isolasi metabolit sekunder bioaktif dari invertebrata laut
1. Giling sampel yang telah dikeringkan dan di ekstrak selama 2-3 siklus, dengan
menggunakan 1 L aseton per 100 g biomassa dengan tujuan untuk mendenaturasi protein
seluler (enzim) dan membebaskan metabolit sekunder dari sel.
Setiap siklus yang di ekstraksi dengan aseton harus didiamkan semalaman pada suhu
kamar dan diaduk menggunakan pengaduk magnet atau magnetic stirrer.
2. Diekstrak residu yang tersisa dari sampel dengan methanol dan didiamkan pada suhu
kamar semalaman dengan diaduk baik menggunakan pengocok otomatis maupun
pengaduk magnet.
3. Gabungkan ekstrak aseton dan metanol dan keringkan di bawah vakum untuk
menghasilkan residu padat atau berminyak. Hal ini dapat dicapai dengan penguapan
sebagian dari ekstrak menggunakan rotary evaporatorR401C sampai penguapan pelarut
sempurna.
4. Larutkan residu dalam volume sekecil mungkin 10% (vol/vol) metanol dalam air dan
fraksinasi menggunakan separator.
5. Keringkan setiap fraksi menggunakan rotavapor untuk menghasilkan residu padat atau
berminyak.Semua fraksi kemudian
6. sesuai dengan sifat komponen fraksi yang beragam,dapat dibedakan menjadi 2 :
o Fraksi polaritas rendah atau sedang
UJI MTT
9. Sitotoksitas diuji terhadap Limfoma tikus L5178Y,tikus H4IIE hepatoma atau garis sel
glioma tikus C6 menggunakn iji MTT.
10. Panen sel yang tumbuh secara eksponensial, hitung dan encerkan dengan tepat. Untuk
setiap ulangan sampel, pipet 50µl yang mengandung 3.750 sel ke dalam pelat mikrotiter
96 sumuran.
11. Tambahkan 50µl larutan sampel uji yang mengandung konsentrasi yang sesuai untuk
masing-masing sumur. menggunakan rentang konsentrasi 3–10 µg ml -1. Untuk senyawa
yang sangat aktif, sampel mungkin harus diencerkan lebih lanjut. Jumlah kecil EtOH
yang ada di sumur tidak mempengaruhi percobaan.
12. inkubasi pelat uji pada suhu 370C dengan 5% CO2selama 72 jam
13. Siapkan larutan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)
pada 5 mg ml-1dalam saline yang mengandung fosfat (1,5 mM KH2PO4, 6,5 mM
Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl; pH 7,4), dan dari larutan ini, pipet volume 20µl
ke setiap sumur. MTT kuning menembus sel hidup yang sehat, dan dengan adanya
dehydrogenase mitokondria, MTT diubah menjadi kompleks formazan biru
14. Inkubasi cawan selama 3 jam 45 menit pada suhu 37 0C dalam inkubator yang
dilembabkan dengan 5% CO2
15. Setelah inkubasi ini, fiksasi sel pada pelat dengan larutan encer yang mengandung 1%
formaldehida dan 1% (berat/vol) kalsium klorida dan kemudian dilisiskan dengan
isopropanol:asam format 95:5 (vol/vol)
16. Ukur absorbansi produk formazan yang terbentuk pada 520 nm menggunakan scanning
microtiter-spectrophotometer. Intensitas warna berkorelasi dengan jumlah sel hidup yang
sehat. Kelangsungan hidup sel dihitung menggunakan rumus :
Bertahan hidup %= 100 x Absorbansi sel yang dirawat - Absorbansi media kultur
Penyerapan sel yang tidak diobati - Penyerapan media kultur
17. Pelajari hubungan struktur-aktivitas senyawa yang terkait secara struktural untuk
mendapatkan senyawa yang dioptimalkan yang dapat digunakan sebagai timbal obat dari
sumber alami.