LAPORAN PRAKTIKUM

FITOKIMIA

PERCOBAAN ISOLASI ANDROGRAFOLIDA DARI HERB SAMBILOTO

(ANDROGRAPHIS PANICULATA)

Di susun oleh :

Nisya Amalia (1508010)

Annisa Maharani (1508010136)
Novita Wulansari (1508010)
Mayriska Nurriyaningsih (1508010)
Nadya Faradani (1508010)
Husna Nurdinarana (1508010)

LABORATORIUM BIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2017
VI. Pembahasan

Pada praktikum ini yang berjudul percobaan isolasi Andrografolida dari herba
sambiloto (Andrographis paniculata), yang mempunyai tujuan agar pada akhir praktikum
mahasiswa diharapkan dapat memahami prinsip dan melakukan isolasi Andrografolida dari
herba sambilooto (Andrographis paniculata) dengan kromatografi kolom, uji aktifitas
antioksidan dengan metode kromatografi lapis tipis, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (KLT-
DPPH) autografi dan analisis kualitatif hasil isolasi dengan metode KLT dan
spektrofotometri UV-Vis.

Andrografolidmerupakankomponen bioaktif utama dari tanaman obat sambiloto

(Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees). Komponeninidapatditemukandi semuabagian
tanaman terutama padabagiandaun.Didalam daun,kadarsenyawaandrografolidsebesar2,5-
4,8% dari berat keringnya (Prapanza danMarianto,2003). Ia memiliki banyak khasiat
dalam dunia kesehatankarenamemilikiberbagai aktivitasfarmakologiseperti menurunkankadar
gula darah, trigliserida danLDL,antiinflamasi vaskuleruntuk mencegahaterosklerosis,
antioksidandananalgesik(Nugrohoet al.,2012; Azlanetal.,2013;Linetal.,2009). Andrografolid
adalah diterpenoid lakton,berupakristaltakberwarnadanmempunyairasa yang
sangatpahit(Chaodan Lin, 2010). Rumus molekulandrografolidadalah C20H30O5.Gambar
struktur andrografolid disajikan dalam gambardi bawah ini

Struktur kimia andrografolid (depkes RI, 2008)

TAKSONOMI3

Secara taksonomi, sambiloto dapat diklasifikasikan sebagai berikut:

Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Subkelas : Gamopetalae
Ordo : Personales

Famili : Acanthaceae

Subfamili : Acanthoidae

Genus : Andrographis

Spesies : Andrographis paniculata Nees

Sambiloto (Andrographis paniculata) adalah sejenis tanaman yang berasal dari famili
Acanthaceae yang berasal dari India dan Srilanka. Khasiat dari (Andrographis paniculata) :

a. Dapat menurunkan demam yang ditimbulkan oleh pemberian vaksin yang

menyebabkan panas pada kelinci.
b. Dapat mengakhiri kehamilan dan menghambat prtubuhan trofosit plasenta.
c. Analgesik dan Antipiretik dengan cara meningkatkan kadar betaendorfin dalam
plasma, betaendorfin merupakan suatu neurotransmiter yang dapat berefek analgesik
antipiretik.
d. Antidiabetes, kondisi stres akan dapat mengacaukan metabolisme tubuh sehingga sulit
mengendalikan kadar gula darah.
Kandungan kimia yang terdapat pada sambiloto :
a. Sambiloto mengandung senyawa flavonoid yang bersifat mencegah sekaligus
menghancurkan penggumpalan darah.
b. Sambiloto memiliki kadar kalium yang tinggi dan rendah kandungan natrium. Kalium
diperlukan untuk mengeluarkan natrium dalam tubuh sehingga bisa menurunkan
tekanan darah. Sementara natrium harus dihindari karena bisa meningkatkan tekanan
darah.

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah serbuk herba sambiloto sebagai
sampel uji, methanol sebagai pelarut dan salah satu komponen fase gerak, DPPH untuk
menguji aktivitas antioksidan, anisaldehida-asam sulfat sebagai penanmpang bercak pada
KLT, lempeng silica GF254 sebagai fase diam KLT, silica G60 sebagai fase diam
kromatografi kolom dan kloroform sebagai komponen fase gerak. Sedangkan alat yang
digunakan seperangkat alat kromatografi kolom serta seperangkat alat kromatografi lapis tipis
dimana keduanya berfungsi untuk memisahkan komponen senyawa yang ada pada herba
sambiloto, cawan porselen sebagai wadah hasil ekstraksi sehingga dapat diperoleh rendemen
ekstrak, kertas saring untuk menyaring filtrate, alumunium foil untuk mencegah penguapan
filtrat, vial untuk menampung fraksi-fraksi dari proses pemisahan, ultrasonic untuk
menunjang poses maserasi dan alat-alat gelas seperti tabung reaksi besar, gelas ukur,
Erlenmeyer, baker glass, botol coklat, batang pengaduk, corong dan pipet tetes.
Prinsip kerja yang digunakan pada praktikum ini adalah serbuk herba sambiloto
diekstraksi dengan menggunakan metanol. Ekstrak metanol herba sambiloto kemudian
dipisahkan dengan kromatografi kolom. Fraksi-fraksi dikelompokkan berdasarkan profil
KLT dan diuji aktifitas antioksidannya dengan menggunakan metode KLT-DPPH autografi.
Pemerian dari andrografolida bentuk berupa campuran daun, bunga, batang, dan buah
kering, warna hijau, tidak berbau, rasa sangat pahir, batang tidak berambut, tebal 2-6mm,
persegi empat, batang bagian atas seringkali dengan sudut agak berusuk. Daun bersilang
berhadapan, umumnya terlepas dari batang, bentuk lanset sampai bentuk lidah tombak, rapuh,
tipis, tidak berambut, pangkal daun runcing, ujung meruncing tepi daun rata. Kelarutan
mudah larut dalam metanol, etanol, piridin, asam asetat, dan aseton tetapi sedikit larut dalam
eter dan air. Secara fisika memiliki titik leleh 228-230̊ dan spektrum uv dengan etanol dengan
panjang gelombang 223nm.
Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian
senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Prinsip kromatografi kolom adalah adanya
perbedaan daya serap dari masing-masing komponen campuran yang akan diuji, dilarutkan
sedikit pelarut lalu dimasukkan kedalam puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat
penyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga akan turun lebih lama.
Zat yang diserap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
kolom. Cara kerja yang dilakukan beberapa tahap, yaitu :
a. Minggu 1

Praktikan mengawali percobaan dengan mengekstraksi herba sambiloto dengan

metode maserasi. Ekstraksi merupakan proses penarikan zat yang dapat larut dari zat
yang tidak dapat larut dengan pelarut yang sesuai. Sedangkan metode yang digunakan
adalah metode maserasi. Maserasi merupakan metode sederhana yang paling banyak
digunakan. Cara ini sesuai, baik untuk skala kecil maupun skala
industri.(Agoes,2007). Metode ini dilakukan dengan memasukkan serbuk tanaman
dan pelarut yang sesuai ke dalam wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar.
Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa
dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut
dipisahkan dari sampel dengan penyaringan. Kerugian utama dari metode maserasi ini
adalah memakan banyak waktu, pelarut yang digunakan cukup banyak, dan besar
kemungkinan beberapa senyawa hilang. Selain itu, beberapa senyawa mungkin saja
sulit diekstraksi pada suhu kamar. Namun di sisi lain, metode maserasi dapat
menghindari rusaknya senyawa-senyawa yang bersifat termolabil selain itu karena
unit alat yang dipakai sederhana (hanya dibutuhkan bejana perendam), biaya
operasionalnya relative rendah dan prosesnya hemat penyari karena tanpa pemanasan.
Tahap ini dilakukan dengan menimbang cawan kosong terlebih dahulu untuk
menghitung rendemen yang diperoleh. Berat cawan kosong yaitu 32,45 gr. Kemudian
menimbang sebanyak 5 gram serbuk herba sambiloto kemudian memasukanya
kedalam tabung reaksi besar. Selanjutnya menambahkan metanol sebanyak 20 ml lalu
ditutup rapat dengan alumunium foil untuk mencegah penguapan oleh methanol.
Penambahan methanol sebagai pelarut yang bertujuan untuk menyari bioaktif yang
ada dalam herba sambiloto karena zat aktif herba sambiloto mudah larut dalam
methanol.Selain methanol, herba sambiloto juga larut dalam etanol, piridin, asam
asetat dan aseton, tapi sedikit larutdalameterdanair (Warditiani elat.,2014).
Kemudian dilakukan proses maserasi selama 1 jam dengan menggunakan getaran
ultrasonifikasi. Penggunaan ultrasonifikasi dalam proses ini merupakan modifaksi
maserasi yaitu maserasi kinetik dengan bantuan mesin pengaduk yang bertujuan agar
proses maserasi lebih efektif dan lebih cepat. Hal inilah yang menyebabkan poses
ekstrasi hanya memerlukan waktu yang cukup singkat Getaran ultarsonifikasiberasal
dari gelombang akustik dengan frekuensi lebih besar dari 16-20 kHz. Dimana
mekanisme kerja dari metode ini adalah gelombang ultrasonifikasi terbentuk dari
pembangkitan ultrason secara local dari kavitasi mikro pada sekeliling bahan yang
akan diekstraksi sehingga terjadi pemanasan pada bahan tersebut, sehingga
melepaskan senyawa ekstrak. Terdapat efek ganda yang dihasilkan, yaitu pengacauan
dinding sel sehingga membebaskan kandungan senyawa yang ada didalamnya dan
pemanasan local pada cairan serata meningkatkan difusi ekstrak. Energi kinetik
dilewatkan ke seluruh bagian cairan, diikuti dengan munculnya gelembung kavitasi
pada dinding atau permukaan sehingga meningkatkan transfer massa antara
permukaan pada-cair. Efek mekanik yang ditimbulkan adalah meningkatkan penetrasi
dari cairan menuju dinding membrane sel, mendukung pelepasan komponen sel akibat
masuknya cairan penyari kedalam sel dan meningkatkan transfer masa (Keil, 2007).
Dengan demikian proses ini dapat mengurangi efek kejenuhan dalam proses pelarutan
kandungan kimia kedalam sel sehingga proses maserasi bekerja secara optimal.
 Setelah proses maserasi tahap pertama selesai, dilakukan proses maserasi tahap kedua
yaitu dengan mengekskrasi kembali residu herba sambiloto yang digunakan pada maserasi
yang pertama tetapi dengan pelarut yang baru dengan jumlah dan jenis yang sama. Metode
ini juga bagian dari modifikasi maserasi yang sering di sebut remaserasi. Remaserasi
bertujuan untuk mendapatkan senyawa atau zat biokatif dalam herba sambiloto secara
maksimal mengingat kelemahan metode maserasi adalah kurang sempurna penyarianya
karena hanya mampu mengekstraksi sebasar 50%. Proses remaserasi dilakukan dengan
getaran ultasonifikasi sehingga maserat yang diperoleh, digabung dengan maserat yang
pertama. Kemudian diuapkan dalam lemari asam. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan
pelarut sehingga diperoleh ekstrak herba sambiloto yang kental. Selanjutnya di peroleh berat
cawan beserta ekstrak yaitu 34.69 gr sehingga diperoleh rendemen sebesar 44.8%. rendement
ini diperoleh dari perhitungan = berat ekstrak yang diperoleh X 100%
Berat serbuk simplisia

Pelarut untuk ekstraksi terdiri atas :

1. Pelarut Non polar : N- heksan, diklorometan, kloroform, benzena, dietil eter, dll.
2. Pelarut polar : air, metanol, etanol, dll.
3. Pelarut semi polar : aseton, etil asetat, dll.

Pada praktikum ini menggunakan pelarut non polar kloroform dan pelarut polar
metanol. Alasan digunakan metanol karena pelarut metanol merupakan pelarut yang
paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam. Cara
ekstraksi yang dilakukan pada praktikum ini adalah maserasi. Maserasi adalah proses
pengekstrakan simplisia dengan beberapa kali pengadukan pada temperatur ruangan (
kamar ). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah
dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Hasil ekstraksi maserasi
disebut maserat, dan digunakan untuk senyawa kimia termolabil. Kuntungan dari
maserasi yaitu : pengerjaan dan peralatan yang sederhana, hanya membutuhkan
bejana perendam, biaya operasional relatif rendah, hemat penyari dan tanpa
pemanasan. Sedangkan kerugiannya adalah pengerjannya lama dan penyarian kurang
sempurna.

Minggu 2,3, dan 4.

 Tahap berikutnya adalah penyiapan kromotografi kolom. Kromatografi kolom
merupakan metode pemisahan yang didasarkan pada pemisahan daya absorbansi suatu
absorben terhadap suatu senyawa baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Seberapa
jauh komponen itu dapat diserap absorben tergantung pada sifat kimia fisika
komponen tersebut. prinsip kerja kromatografi kolom adalah adanya perbedaan daya
serap dari masing-masing komponen campuran yang akan diuji kemudian dilarutkan
oleh sedikit pelarut . senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun
lebih lambat dari senyawa no polar yang lebih lemah afinitanya dengan absoben
sehingga turun lebih cepat.
Penyiapan ini dilakukan dengan dengan cara menempatkan penyaring pada
ujung kolom yang bertujuan untuk menahan senyawa yang telah terpisah sehingga
pada saat proses elusi tidak terlalu cepat keluar dari kolom dan menyaring suatu
pengotor yang mungkin berada dalam fase diam.
Lalu menimbang silica G60 sebanyak 15 gram sebagai fase diam. Silica G60
merupaka mineral alami yang dimurnikan dan diolah menjadi salah satu bentuk
butiran seperti kaca yang sangat berpori. Silica dibuat secara sintesis dari natrium
silikat dan memuliki afinitas yang kuat untuk molekul air. Sifat silica yang dapat
menyerap disebabkan karena terbentuk melalui sol NaSiO2. Sol yang mirip dengan
agar-agar ini dapat didehidrasi sehingga berubah menjadi padatan atau butiran kaca
yang bersifat elastis. Fase diam ini nantinya akan berfungsi untuk menahan komponen
senyawa karena ia memiliki karakteristik yang sama dengan fase diamnya.
Kemudian membuat fase gerak yaitu kloroform-methanol dengan perbandingan
(98:2) yang dibuat sebanyak 80 ml sehingga jumlah pelarut yang digunakan adalah
kloroform 78,4 ml sedangkan methanol 1,6 ml. Fase gerak berfungsi untuk
melarutkan zat komponen campuran dan membawa komponen melalui media hingga
terpisah dari komponen. Fase gerak klorofrm;methanol ini merupakan fase gerak yang
meewakili senyawa semi polar. Hal tersebut dikarenakan kloroform merupakan
pelarut organic sehingga bersifat non polar sedangkan methanol merupakan pelarut
yang bersifat polar. Lalu fase diam yang sudah di timbang, dilarutkan dengan sedikit
campuran fase gerak kemudian digojok hingga terdistribusi (homogen) sempurna. Hal
ini bertujuan agar fase diam secara keselurtuhan kontak dengan fase gerak sebab jika
serbuk silica tidak dicampurkan dengan fase gerak dan langsung dimasukan kedalam
kolom, dikhawatirkan ada beberapa bagian tertentu yang tidak terbasahi oleh fase
gerak sehingga akan mempengaruhi proses elusi. Setelah homogen, memasukan fase
 diam secara hati-hati sambil dibuka penutup kran kolom. Hal ini berujuan agar serbuk
fase diam dengan cepat turun kebawah karena terbawa oleh cairan yang melarutkanya.
Setelah fase diam seluruhnya masuk, menambahkan sedikit fase diam diatas
permukaan silica sepanjang 1-2 cm. Hal ini bertujuan agar fase diam tidak kering dan
tidak membentuk cracking yang dapat mempengaruhi proses elusi. Penambahan fase
gerak juga harus hati-hati agar dinding kolom tida rusak dan tidak terbentuk roongga
udara pada fase diam yang akan mengakibatkan pemisahan tidak sempurna.
Proses penambahan fase gerak dilakukan sebaik mungkinn dan homogen serta
menghindari adanya gelembung udara sebab gelembung udara dapat menyebabkan
putusnya penyerapan kolom. Selanjutnya adalah proses pencucian selama kurang
lebih 15 menit yang bertujuan untuk menjenuhkan atmosfer kolom oleh fase gerak
sehingga proses elusi dapat berjalan cepat dan dengan kecepatan elusi yang sama dan
stabil.

Selanjutnya adalah proses elusi ekstrak sambiloto. Elusi adalah proses dimana
zatterlarutdibawamelewati media pemisaholehaliransuatupelarutberbentukcairanatau
gas. Tipe elusi yang digunakan adalah tipe elusi gradien, yaitu suatu proses elusi
dengan adanya perubahan komposisi atau tingkat kepolaran fase gerak selama elusi.
Perbandingan fase gerak yang digunakan adalah 95:5 ; 90:10 ; 80:20 ; 70:30 dan
50:50 dibuat 30 mL.

Prinsip kerja dari kromatografi kolom adalah “Like dissolve like”, yaitu
senyawa yang polar akan tertahan pada komponen yang polar, dan senyawa yang non
polar akan terbawa oleh komponen non polar. Oleh sebab itu komponen tunggal atau
ekstrak dapat tertahan.
 Fase diam yang digunakan adalah silika G 60, yang bersifat polar. Permukaan
silika gel mengandung gugus silanol. Gugus hidroksil ini adalah pusat aktif dan berpotensi
dapat membentuk ikatan hirogen yang kuat dengan senyawa yang dipisahkan. Silika gel
membentuk ikatan hidrogen terutama dengan donor H seperti alkohol, fenol, amina,
amida, dan asam karboksilat (Palleros, 2000). Pada umumnya, semakin kuat kemampuan
ikatan hidrogen suatu senyawa, semakin kuat akan tertahan oleh silika gel.

Senyawa yang tertahan pada fase diam memiliki afinitas yang kuat dengan fase
diam. Sedangkan senyawa yang bersifat non polar memiliki afinitas yang lemah terhadap
fase diam. Hal tersebut dibuktikan bahwa pada proses pemisahan terdapat bebraoa
komponen senyawa yang ada dalam ekstrak sambiloto tertahan oleh fase diam. Hal
tersebut disebabkan pada struktur andrografolid mengandung gugus O sehingga dapat
membentuk ikatan hidrogen. Sedangkan, komponen senyawa andrografolida yang
terbawa oleh fase gerak memiliki karakteristik yang sama dengan fase geraknya dimana
fase geraknya dominan non polar. Dengan demikian, diperoleh beberapa fraksi hasil dari
pemisahan tersebut yaitu sejumlah 18 vial. Fraksi tersebut diperoleh dari proses frakinasi
dimana merupkan suatu proses pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan tingkat
kepolaran sehingga menghasilkan senyawa yang murni. Dalam proses fraksinasi ini
menggunakan proses fraksinasi bertingkat yang diawali dengan proses pengelusian
menggunakan pelarut yang kurang polar, dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar.

Perbandingan No Vial
(Kloroform : Metanol)
95 : 5 1-3
90 : 10 4-6
80 : 20 7-10
70 : 30 11-13
50 : 50 14-15

Tabel diatas menunjukkan setiap perbandingan pealrut sebagai fase gerak

dieroleh kelipatan tiga hanya sampai perbandingan 70 : 30. Sedangkan pada
perbandingan fase gerak yang terakhir yaitu 50 : 50 hanya mendapatkan 2 vial. Hal ini
disebabkan karena fase gerak yang digunakan kemungkinan besar menguap dan menjaga
agar fase diam tetap basah dan tidak membentuk cake. Masing-masing fraksi yang didapat
kemungkinan masih mengandung senyawa yang berbeda. Sehingga untuk mengetahui
memiliki komponen senyawa yang sama dilakukan KLT untuk mengelompokkan senyawa
yang memiliki kemiripan yang sama. Prinsip dari fraksinasi adalah penggabungan senyawa
yang berdasarkan bercak noda pada lempeng dengan pengamatan pada UV 254 nm dan
366. Tujuan dilakukan penggabungan adalah untuk memisahkan dan memperoleh
senyawa dalam jumlah yang maksimal, dimana penggabungannya didasarkan pada nilai Rf
yang sama dan penampakan warna yang ditunjukkan itu sama. Intinya, fraksi dengan Rf
yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama.

Kromatografi Lapis Tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar yang
merupakan suatu metode untuk mengidentifikasi senyawa dan menguji kemurnian
coumpounds. Fase diamnya (Stasionary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada
glass/kaca, plastik, alumunium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase)berupa cairan
atau campuran cairan, biasanya pelarut organik dan kadang-kadang juga air. Fase diam
yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan menbentangkan/meratakan fase diam
(adsorben) diatas lempeng kaca plastik atau alumunium.

Prinsip dari pemisahan ini adalah like disolve like, dimana komponen yang
interakdinya lebih kuat dengan fase diam akan tertahan pada fase diam tersebut dan
sebaliknya. Kelebihan dari KLT untuk tujuan analisis yitu dengan identifikasi pemisahan
komponen dapat dilakukan dengan reaksi warna, fluoresensi atau dengan radiasi
menggunakan sinar UV. Lalu ketepaan penentuan kadar akan lebih baik karena penentuan
komponen yang akan dilakukan karena bercak yang tidak bergerak, hanya membutuhkan
sedikit pearut, harga yang dibutuhkan terjangkau, jumlah perlengkapan sedikit dan
preparasi sample yang mudah.

Fase gerak tersebut dimasukkan kedalam chamber dan dijenuhkan. Tujuan

dijenuhan agar tekanan atmosfer didalam bejana pada semua sisi sama. Sehingga ketika
proses elusi, fase gerak yang naik pada lempeng mempunyai kecepatan yang sama.

Fase diam yang digunakan yaitu lempeng silica gel GF254, yaitu silica yang
mengandung pengikat gipsumdan indikator fosforosensi timah kadmium sulfida atau
mangan timah silikat aktif yang berforosensi pada panjang gelombng 254 nm. Lempeng
tersebut diberi tanda batas bawah 1 cm dan atasnya 0.5 cm. Batas bawah berfungsi
sebagai titik awal penotolan sample. Sedangkan batas atas menjadi titik akhir elusi. Elusi
tersebut dihentikan ketika telah mencapai batas akhir. Setelsh diberi batas, lempeng
dimasukkan kedalam oven selama 15 menit kedalam oven untuk diaktifkan dengan tujuan
menghilangkan kadar air dipermukaan lempeng. Karena jika makin banyak kandungan air,
adsorben akan lebih banyak diduduki oleh air dan titik aktifnya akan menjadi tidak aktif.
Sehinggan proses elusi tidak akan berjalan dengan baik.

Setelah jenuh, masukan fase diam ke dalam chamber. Bercak sampel pada garis
awal jangan sampai tercelup ke dalam fase gerak, fase gerak akan merambat naik
membawa komponen sampel. Kecepatan merambatnya berbeda tergantung kekuatan
persaingan ikatan hydrogen yang terjadi antara fase diam dan fase gerak. Silica gel GF254
bersifat polar, sehingga kompponen yang bersifat polar akan tertahan pada fase diam
karena terbentuknya ikatan hydrogen, dan sebaliknya.

Jadi pada lempeng KLT terdapat 7 totolan, yaitu pada vial no 3,6,9,12, dan 15
serta ekstrak dan pembanding. Setelah proses elusi lempeng di kering anginkan.
Sebelumnya vial yang akan ditotolkan ditambahkan methanol terlebih dahulu karena
pada vial sudah berbentuk ekstrak sehingga harus dilarutkan terlebih dahulu agar
memudahkan pengambilan sampel dengan pipa kapiler. Penotolan diusahakan sekecil
mungkin agar hasil bercak yang didapat tidak melebar yang akan mengganggu proses
scanning dan memungkinkan terjadinya himpitan puncak.

Tahapan selanjutnya melakukan deteksi pada sinar tampak, sinar UV dengan

panjang gelombang 254 dan 366 nm, pereaksi anisaldehid-asam sulfat dan dipanaskan
dengan suhu 110oC selama 10 menit. Tujuan dipanaskan pada oven untuk
menampakan bercak noda larutan anisaldehid karena pada suhu kamar larutan
anisaldehid tidak menibulkan warna pada noda. Penampakan noda pada sinar UV 254
nm dan 366 nm disebabkan karena adanya interaksi antara sinar UV dengan gugus
kromofor yang terikat oleh ausokrom yang terdapat pada noda tersebut. Gugus
kromofor adalah gugus atom yang dapat menyerap radiasi elektromagnetik (sinar UV)
dan mempunyai ikatan rangkap tak jenuh (terkonjugasi). Sedangkan gugus
terkonjugasi adalah struktur molekul dengan ikatan rangkap tak jenuh lebih dari satu
yang berada berselang-seling dengan ikatan tunggal. Flouresensi warna yang tampak
tersebut merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika
elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi tinggi. Perbedaan
energi emisi yang dipancarkan pada saat kembali ke energi dasar inilah yang
 menyebabkan perbedaan flouresensi warna yang dihasilkan oleh tiap noda.Pada UV
254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna
gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi
antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi
cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen
tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi
yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.
Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV
254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366
nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau
366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya (Gibbons, 2006).

Rf (retension factor) merupakan ukuran keepatan migrasi suatu komponen

pada kromatografi dan pada kondisi tetap merupakan peranan karakteristik dan
produksibel. Atau dengan kata lain Rf adalah perbandingan jarak yang ditempuh
komponen terhadap jarak yang ditempuh pelarut atau fase gerak. Semakin besar nilai
Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada
lempeng KLT. Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasi senyawa
tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip dan sebaliknya.
Sehingga apabila nilai Rf yang didapat hampir sama artinya fraksi tersebut dapat
digabungkan menjadi satu fraksi.

Kemudian spot-spot tersebut dideteksi dengan anisaldehid-asam sulfat, karena

merupakan ia penampang pereaksi yang cocok untuk mrnimbulkan warna untuk
golongan flavonoid dan spot-spot membentuk warna violet-pink. Menurut literature
warna tersebut kemungkinan besar merupakan senyawa andrografolida (Ervonita.
1993). Sedangkan jika berwarna hijau-kekuningan menurut literature warna tersebut
kemungkinan merupakan senyawa golongan diterpen (Harbone. 1987). Mekanisme
pereaksi anesaldehida dalam menimbulkan warna adalah

b. Minggu 6
Dengan berdasarkan pengamatan yang diperoleh dari hasil elusi lempeng KLT
sebelumnya sehingga dapat memungkinkan dilakukan penggabungan fraksi. Proses
pengelompokan tersebut dinamakan fraksinasi yaitu pengelompokan yang
berdasarkan sifat- sifat kimia. Melalui fraksinasi maka senyawa hasil ekstrak
dipisahkan menjadi kelompok senyawa yang menjadi sederhana. Pengelompokan
dilakukan berdasarkan kemiripan dari nilai Rf yang memiliki pola kromatografi yang
mirip, sehingga dapat dikelompokkan menjadi 4 kelompok fraksi besar yaitu
kelompok 1 berupa vial nomor 1-6, kelompok 2 berupa vial nomor 7-9, kelompok 3
berupa vial nomor 10-12, kelompok 4 berupa vial 13-15 . Dari masing-masing fraksi
dilarutkan dengan menggunakan pelarut metanol secukupnya.
Dilakukan pengujian kembali dengan KLT. KLT perlu dilakukan untuk
melakukan monitoring keberadaan senyawa hasil ekstrak atau fraksinasi. Prosedur
pemisahan ini dikatakan paling baik karena tidak melibatkan pH dan suhu ekstrim
maupun asam-basa sehingga dapat mempertahankan strukstur maupun sifat biologis
sampel. Keuntungan metode ini yaitu dapat menguji secara kualitatif banyak senyawa
secara bersamaan, dapat dilakukan dengan mudah tanpa sumber listrik, cepat dan
datanya reliabel, sistem peralatan sederhana, murah dan mudah dimodifikasi.
Prinsip KLT yaitu campuran solut yang akan dipisahkan ditotolkan pada
permukaan lempeng tipis lalu dikembangkan di dalam chamber menggunakan fase
gerak yang sesuai. Kekuatan interaksi yang berbeda antara molekul solut dengan fase
diam atau fase gerak akan menghasilkan mobilitas dan pemisahan yang berbeda.

Digunakan fase gerak berupa campuran kloroform- metanol dengan

perbandingan 7:1 dibuat dengan volume sebanyak 8 ml, fase diam berupa lempeng
silika GF254 dan larutan pembanding yaitu andrografolida standar. Plat silika yang
digunakan diberi batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm. Batas atas untuk
memudahkan saat dilakukan monitoring sehingga dapat diketahui batas
berhentinya eluen. Batas bawah yang disesuaikan dengan tinggi dari volume eluen
8 ml dari dasar chamber. Penotolan dalam praktikum ini dilkukan dengan
menggunakan pipa kapiler. Setelah dilakukannya proses elusi, pada lempeng
dilakukan pengamatan bercak Rf dan pengamatan warna yang dibantu dengan
penampakan sinar UV 254 nm dan 366 nm serta digunakan pereaksi semprot yaitu
DPPH.

Hasil KLT ini dilihat dengan sinar UV 254 nm, dimana lempeng silika gel
sebagai latar belakang akan berfluoresensi atau berpendar, sedangkan dengan sinar
UV 366 nm lempeng silika gel akan berwarna gelap sedangkan pita atau bercak yang
terbentuk akan berfluoresensi. Ditambahkan perekasi membentuk warna dengan
penyemprotan, penyemprotan sampel dilakukan dengan harapan diperoleh golongan
senyawa yang dimaksud dengan pereaksi yang digunakan. Setelah didapatkan bercak
dihitung randemennya dan didapatkan hasil nilai Rf pada tiap bercak adalah pada
fraksi besar 1 adalah 0,91, fraksi besar 1 adalah 0,74, fraksi besar 3 adalah 0,57, fraksi
besar 4 adalah 0,28, pembanding adalah 0,82, dan ekstrak 0,94.

Selanjutnya adala dilakukan pengujian aktivitas antioksidan yang digunakan

adalah metode kromatografi lapis tipis dengan penampak bercak berupa DPPH 0,04%
untuk analisis kualitatif senyawa antioksidan Pada praktikum digunakan senyawa
pereaksi berupa DPPH untuk mendeteksi senyawa dengan aktifitas antioksidan yang
akan membentuk kompleks warna ungu. Dpph adalah suatu senyawa organic yang
mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat engan panjang gelombang
maksimum 517nm. Prinsip DPPH adalah didasarkan pada reaksi penangkapan atom
hydrogen oleh dpph (reduksi dpph) dari senyawa antioksidan, reagen dpph sebagai
radikal bebas yang direndam oleh senyawa antioksidan yang terkandung dalam
sampel, selanjtnya dpph akan tereduksi menjadi senyawa diphenyl picryl razine (ppp-
h) reduksi tersebut menyebabkan perubahan warna reagen dpph dari ungu menjadi
kuning. Pada senyawa flavonoid memiliki kemampuan antioksidan yang mampu
menstransfer sebuah electron ke senyawa radikal bebas dan membentuk kompleks
dengan logam.
 Kedua mekanisme tersebut flavonoid memiliki efek diantaranya menghambat
peroksidasi lipid, menekan kerusakan jaringan oleh radikal bebas, dan
menghambatbeberapa enzim penting.

Setelah disemprot dengan larutan dpph, dihitung waktu pudar warna sampel
dari violet-pink menjadi putih akibat adanya reaksi tersebut. Waktu yang diperoleh
fraksi sampai memberi warna putih selama 4 menit. Menurut literature

Dilakukan penentuan nilai Rf yang didefinisikan sebagai jarak migrasi solute

terhadap ujung fase geraknya yang bertujuan untuk mengidentifikasi golongan
senyawa yang ada pada sampel. Diperoleh nilai Rf untuk fraksi 1 yaitu (ISI
SENDIRI). Untuk nilai Rf dari sampel ekstrak hasil ekstraksi diperolah nilai Rf
yaitu (ISI SENDIRI)

Adapun faktor- faktor yang dapat mempengaruhi nilai Rf, yaitu:

1. Silika gel bersifat polar yang mudah mengikat uap air (OH) sehingga silika gel
harus diaktifkan terlebih dahulu dengan dipanaskan agar gugus OH dapat
menguap karena adanya OH dapat mengganggu reaksi karena mudah berikatan
dengan pelarut polar.
2. Kejenuhan chamber. Jika tidak jenuh maka pengembangan tidak maksimal
karena hanya akan membawa pelarut dari bawah keatas. Terkadang naik
bersama pelarut hanya membentuk garis lurus diatas sehingga seolah-olah tidak
ada kandungan senyawanya.
3. Memasukkan plat atau lempeng kedalam chamber harushati-hati yang kemudian
diletakkan secara tegak agar tidak mendorong ekstrak pada satus isi. Kemudian
chamber segera ditutup setelah plat dimasukkan agar eluen tidakmenguap.

Pengujian aktifitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan pereaksi

semprot larutan 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 0,04%, yang dibuat dengan
menimbang 40,0 mg kristal DPPH dalam erlenmeyer tertutup yang dibungkus
dengan alumunium foil, lalu ditambahkan 100,0 ml metanol dalam kondisi gelap.
Larutan DPPH dijaga pada suhu rendah, terlindung dari cahaya dan segera
digunakan. Senyawa DPPH akan bereaksi dengan senyawa antioksidan dengan
cara pengambilan atom hidrogen dari senyawa antioksidan untuk mendapatkan
pasangan elektron. Kelebihan dari metode DPPH adalah mudah, cepat, sensitif,
sederhana, akurat, efektif sedangkan kelemahannya adalah hanya dapat
memberikan informasi mengenai aktifitas senyawa yang diuji dan hanya dapat
mengukur senyawa antiradikal yang terlarut dalam pelarut organik khususnya
alkohol. Hasil percobaan mengidentifikasi adanya senyawa antioksidan yang
terkandung pada fraksi besar 1.
VI. Kesimpulan

1. Mahasiswa telah memahami prinsip dan melakukan isolasi andrografolida dari herba
samboloto (Andrographis paniculata) dengan kromatografi kolom, uji aktivitas
antioksidan dengan metode kromatografi lapis tipis-2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil
(KLT-DPPH) autografi dan analisis kualitatif hasil isolasi dengan metode KLT dan
spektrofotometri UV-Vis.

2. Herbasambiloto(Andrographispaniculata) merupakantumbuhanasli Indonesia yang

secarafarmakologismeempunyaisifatantara lain antiradang, analgesik, antibakteri,
antimalaria, hepatoprotektif, penawarracun, meenstimulasisistemimun,
menghambatseltumor, sertauntukpengobatanantara lain pengobatanuntukpenyakit
hepatitis, radangparu, TBC, diare, dantipusabdominalis.

3. Sambilotomengandungditerpenlaktondengankomponenbioaktifutamaberupaandrograf
olida, berukakristaltakberwarnadanmempunyai rasa yang sangatpahit.

4. Hasilpercobaanmenunjukkanadanyapenampakansegerawarnaungupadafraksi 1
dansampelektstrakherbasambiloto(Androghaphispaniculata) yang
mengidentifikasikanadanyasenyawa yang bersifatantioksidan.

LANJUTIN YAAAA

ABIS BINGUNG KESIMPULANNYA APA AJA HAHAHA